MBI12 Moleculaire Biologie 1.

Presentatie over: "MBI12 Moleculaire Biologie 1."— Transcript van de presentatie:

1 MBI12 Moleculaire Biologie 1

2 Opbouw module 2 studiepunten (2 ECTS)
8 weken lang 1 x per week (hoor/werk) college aan de hand van PPT en vragen Tentamen met open (invul) vragen (zie vb) Hertentamen met open (invul) vragen Docent: LangK in de map MBI12 De theorie wordt toegepast in MBP12 en is nodig voor BIF12

3 Inhoud module Opbouw en synthese DNA, RNA en eiwitten Kloneren
Detectiemethoden (blotten en hybridiseren, PCR, sequencen, …) Genexpressie en regulatie PCR + variaties RFLPs, snp’s ed.

4 DNA

5 Hoe is DNA opgebouwd? DNA = desoxyribo-nucleinezuur
Deze structuur staat nu bekend als B-DNA en heeft de vorm van een α–helix.

6 Een poly-nucleïnezuur keten heeft een begin (5’-uiteinde) en een eind (3’-uiteinde).
De koolstofatomen van de suiker geeft men aan als C1’ t/m C5’. De koolstofatomen van de stikstofbasen met C1 t/m C…. Aan het 5’C-atoom zit de fosfaatgroep, aan de 3’OH groep de OH-groep waar een nieuwe nucleotide aan kan binden

7 RNA heeft een ribose als suikergroep
De nucleotiden van RNA en DNA verschillen van elkaar in de suikergroep en in de stikstofbasen. 1 nucleotide RNA heeft een ribose als suikergroep DNA heeft een deoxyribose als suikergroep

8 AT heeft 2 waterstofbruggen,
GC 3 antiparallel

9 In de cel komen meerdere vormen van nucleotiden voor:
De nucleotiden die in DNA of RNA voorkomen bevatten 1 fosfaatgroep, de zg. dNMPs of NMPs Nucleotiden kunnen ook 2 of 3 fosfaatgroepen bevatten. Dat is aan de afkorting (en de naam ) af te lezen. AMP, ADP, ATP of (Mono, Di of Tri). Aan de afkorting van een nucleotide (dATP/ATP) is af te lezen of het om een nucleotide voor DNA (d) of voor RNA gaat.

10 Kan je DNA zien??? Het DNA dat in de kernen van een cel zit kan je zien m.b.v. een lichtmicroscoop. Een derde methode om DNA te detecteren is de spectrofotemetrische bepaling. Het geïsoleerde DNA kan zichtbaar worden gemaakt m.b.v. agarose gelelectroforese.

11 Het centrale dogma Het centrale dogma geeft aan via welke route het DNA tot expressie komt en dat het DNA vermenigvuldigd wordt. Het geprocesste RNA kan de kern verlaten. Bij Prokaryoten vinden alle processen in dezelfde ruimte plaats. Processing, zoals bij de eukaryoten, gebeurt niet. eukaryoten

12 Replicatie (synthese) van DNA
Het DNA afhankelijk DNA polymerase heeft nodig: een matrijs een 3`OH -groep aan een stukje ds DNA En dNTPs. De energie die vrij komt bij afsplitsing van twee fosfaatgroepen maakt de binding van de nucleotide aan het 3` OH mogelijk. De syntheserichting van DNA is (gezien vanuit de te synthetiseren streng) van 5`naar 3`.

13 Elk nieuw stukje DNA start met een RNA- primer.
Nadat de DNA-synthese door DNA afhankelijk DNA polymerase is begonnen, wordt het RNA verwijderd (RNase = endonuclease). De gaten (gaps) worden daarna met dNTPs opgevuld door (een ander) DNA polymerase. Bij eukaryoten zijn meerdere DNA polymerases actief. De synthese van de DNA stukjes in de lagging strand worden Okazaki fragmenten genoemd.

14 DNA replicatie start altijd bij een ORI
DNA replicatie start altijd bij een ORI. Een ORI is de origin of replication, een specifieke nt volgorde. Daar begint de replicatie vork. Eukaryotisch DNA heeft meerdere ORI’s en dus ook meerdere replicatievorken Het DNA Polymerase herkent m.b.v. 6 andere eiwitten de ORI sequentie. Iedere ORI heeft 2 replicatievorken Bacterieel DNA heeft maar 1 ORI.

15 DNA polymerase blijkt naast de synthese activiteit nog twee andere activiteiten te hebben:
Exonuclease van 5’→ 3’ Exonuclease van 3’→ 5’ Tijdens de replicatie worden door het DNA polymerase fouten gemaakt. Dit gebeurt 1 : nt’s. Na de “proofreading” van het DNA polymerase vinden we nog maar 1 : 109 foute nt. terug. Op zie je het DNA polymerase aan het werk.

16 Genen komen tot expressie
Een gen is een stukje DNA dat codeert voor messenger RNA (mRNA), ribosomaal RNA (rRNA ) , transfer RNA (tRNA) of een ander RNA. Wij hebben ± genen die verspreid liggen over onze 46 chromosomen. Ze nemen slechts 1% van al ons DNA in beslag !!

17 Transcriptie Het enzym DNA afhankelijk RNA polymerase leest de DNA streng af en maakt een enkelstrengs RNA molecuul De helix wordt plaatselijk en tijdelijk ontwikkeld. Het RNA molecuul wordt gesynthetiseerd van 5’  3’. De synthese start bij de promotor en eindigt bij de terminator.

18 Een voorbeeld van een prokaryotische promotor
Het -10 gebied wordt ook wel de Pribnow-box genoemd. RNA polymerase is voor de start van de transcriptie afhankelijk van een eiwit, Bij Prokaryoten is dat de σ-factor. Bij eukaryoten zijn vele andere eiwitten actief, de transcriptiefactoren (TF’s).

19 Terminatie van de transcriptie
De transcriptie wordt beëindigd door een terminatie-signaal

20 Processing van het mRNA.
In een eukaryoot wordt in de kern een primair transcript gemaakt. Dit wordt ook wel pre-mRNA of hnRNA genoemd. (hn = heterogeen nucleair). Processing bestaat uit 3 stappen: Splicing (= verwijderen van de introns) Capping (= het aanbrengen van een omgekeerde nucleotide aan het 5’-uiteinde). Poly-A-tail. Aan de 3’-kant wordt een A-tail aangebracht. Dit kunnen er honderden zijn!

21 Splicing Het splicen wordt (meestal) uitgevoerd door snRNPs=
Small nuclear RiboNucleoProteins (Uitspreken als snurps) Een actief spliceosoom (of snRNP) in detail

22 Bij “capping” wordt een nucleotide achterstevoren aan het 5’-uiteinde van de eerste nt van het mRNA gebonden. Hieronder is dat in detail te zien. De capstructuur beschermt het mRNA tegen afbraak (door bv. Exonucleases)

23 Poly-adenylering vindt plaats als het poly-adenyleringssignaal (= sequentie) is gepasseerd
Er worden 50 – 300 A’s aan de 3’-kant van het RNA bevestigd. Poly-A polymerase is hiervoor verantwoordelijk.

24 De translatie: De translatie wordt in het cytoplasma uitgevoerd door ribosomen die het mRNA lezen. tRNAs brengen de aminozuren naar de actieve ribosomen toe. Per 3 nucleotiden wordt 1 aminozuur geplaatst. De tripletcode of de codons.

25 De genetische code (tripletcode) in beeld.
Een eiwit begint met een AUG (= de code voor Methionine) Het einde van een eiwit wordt op het mRNA aangegeven met een stopcodon.

26 Open leesramen.

27 De ribosomen. Een ribosoom is een complex (riboproteincomplex) van eiwitten en 3 verschillende rRNA’s. Een ribosoom bestaat uit twee subeenheden: de kleine en de grote subeenheid De nucleolus in beeld

28 De translatie stap voor stap.
In elk elk ribosoom zijn 3 plaatsen te onderscheiden voor de binding van een tRNA. tRNA – Met bindt als eerste.

29 DNA TRANSCRIPTION mRNA Ribosome TRANSLATION In de een prokaryoot vinden alle processen in 1 ruimte plaats. Bovendien zijn de transcriptie en de translatie (aan elkaar) gekoppeld; ze vinden tegelijk plaats. In een eukaryoot is de transcriptie in de kern en de translatie in het cytoplasma; beide processen vinden niet tegelijk plaats. Polypeptide (a) Bacterial cell Nuclear envelope DNA TRANSCRIPTION Pre-mRNA RNA PROCESSING mRNA TRANSLATION Ribosome Polypeptide (b) Eukaryotic cell

30 De gekoppelde transcriptie-translatie bij een prokaryoot in beeld.

31 De synthese van eiwitten op vrije en gebonden ribosomen.
Eiwitten die door de gebonden ribosomen worden gemaakt komen in het ER terecht, vanwaar uit ze naar verschillende organellen in de cel of naar buiten worden verstuurd. Op de vrije ribosomen worden vooral eiwitten gemaakt die in het cytoplasma blijven.

32 Het effect van verschillende mutaties op de aminozuursamenstelling

33 Tot slot: een “Overall” beeld van de transcriptie en de translatie in een eukaryoot

34 Van chromosoom tot DNA (of andersom)!
EM-opnames Chromatine chromosoom

35 De vorm van het DNA hangt af van de fase van de celcyclus.
Alleen tijdens de M-fase heeft het DNA de gecondenseerde vorm van een chromosoom. De rest van de tijd heeft het de vorm van chromatine (eu- of hetero)

36 Chromatine De DNA-keten wikkelt zich om 8 positief geladen
histon-eiwitten. Er zijn 4 verschillende histon eiwitten. Zo’n octameer-complex wordt een Nucleosoom genoemd. De nucleosomen liggen verspreid over het DNA en worden ook wel kralen aan een ketting genoemd of “strings on a bead”.

37 Het histon-DNA complex nog meer in detail.

38 Eu- en heterochromatine
Chromatine kan meer of minder in elkaar gedraaid zijn (compacter). Euchromatine is de minder gecondenseerde vorm van chromatine… deze vorm is actief! Heterochromatine is de meer gecondenseerde vorm van chromatine. Deze vorm is niet actief! Er vindt bv. geen transcriptie plaats!!

39 Sommige gebieden (telomeren en centromeer) zijn nooit actief.
In andere gebieden kan het Chromatine ge-activeerd en ge-inactiveerd worden (van eu-chromatine naar heterochromatine). Hierbij spelen methylatie en acetylatie een belangrijke rol.

40 In de chromosomen heeft het DNA de vorm
van een dubbelstrengs lineair polymeer molecuul. Aan een chromosoom zijn verschillende onderdelen te onderscheiden; de chromatiden, het centromeer, de p-arm, de q-arm en de telomeren De telomeren zijn de uiteinden van de chromosoomarmen

41 Nogmaals van α-helix naar chromosoom

42 Homework Maak de vragen van week 1 (zie map MBI12)