DNA micro arrays Heel recente techniek

Presentatie over: "DNA micro arrays Heel recente techniek"— Transcript van de presentatie:

1 DNA micro arrays Heel recente techniek
Gene array, GeneChip (Affymetrix), genome chip Huidig probleem: grote hoeveelheden RNA-nodig 2-5 µg mRNA; cellen; 1 tot 10 mg weefsel Gebaseerd op reverse hybridizatie Niet gelabelde probes op glas of membranen (nylon of nitrocellulose) in spots kleiner dan 200 µm 2 grote varianten (zie artikelen) Niet geschikt voor de novo gen ontdekking

2 DNA micro arrays cDNA-probes
Probes 500 tot 5000 basen, aanmaken van cDNA libraries met PCR, OPZUIVERING Met spotting robot immobiliseren op drager Nadelen: lange probes kunnen aanleiding geven tot mismatch hybridisatie, arbeidsintensief Voordeel: kan zelf aangemaakt worden Zie artikel vb van gen expressie studie

3 DNA micro arrays GENEXPRESSIE studies
Verschillen in gen expressie tussen cellen bestuderen (ziekte-gezond, met-zonder stimulus,...) RNA extractie, met oligo-dT primer cDNA synthese met fluorescente labels Cye3-dUTP of Cye5-dUTP Transcription bias oplossen door vergelijkende studie Na hybridizatie scannen met laser an CCD camera

4 DNA micro array met cDNA probe

5 DNA micro array met cDNA probe

6 DNA micro arrays Oligonucleotide arrays
Probes basen, kunnen rechtstreeks op chip (glas slide) gesynthetiseerd worden Fotolithografie en oligonucleotide synthese

7 Oligonucleotide arrays

8 Oligonucleotide arrays
Probes basen, kunnen rechtstreeks op chip (glas slide) gesynthetiseerd worden Fotolithografie en oligonucleotide synthese Nadeel: moet door firma aangemaakt worden (custom synthese) Affymetrix Voordeel: polyvalenter, specifieker door meerdere kortere probes per gen, mismatch controles Zie artikel

9 Oligonucleotide arrays
Toepassingen: Gen-expressie vergelijkbaar met cDNA-probe micro arrays Meerdere probes per te bestuderen gen Perfect match – mismatch probes Kunnen voor een aantal toepassingen aangekocht worden (zie atikel) GEBRUIK: Gen-expressie voor klassificatie van kankers, ziekte progressie voorspellen, gevoeligheid voor bepaalde therapeutica voorspellen

10 Oligonucleotide array GENEXPRESSIE studies

11 Oligonucleotide array GENEXPRESSIE studies
Typisch resultaat na verwerking door computer Geclusterde gen expressie Groen betekent minder dan referentie cellen Rood meer dan referentie cellen Zwart gelijke expressie

12 Oligonucleotide arrays
Toepassingen: Gen-expressie DNA-sekwentie informatie Testen voor gekende mutaties in ziekte genen Single nucleotide polymorfimsen DNA sequentie bepalen van een bepaald gen KAN ENKEL MET OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS

13 Oligonucleotide arrays
Bepalen van de DNA sekwentie van een bepaald gen, of sommige genen Detectie van mutaties, substituties

14 Oligonucleotide arrays
Detectie van verschillende allelen van een bepaalde DNA-sequentie Polymorfismen van genen SNP analyse en mapping

15 Allel specifieke oligonucleotide hybridizatie ASO
Dot-blotting, target DNA op membraan (nylon, nitrocellulose) aanbrengen en binden Denatureren en gelabelde probe hybridiseren, wassen en detectie (radio-actief of niet radioactieve technieken (zie vroeger)) Kan gebruikt worden voor detectie van puntmutaties ASO-probe nucleotiden, verschil centraal in probe Ook reverse dot-blot met ASO, ongelabelde probe gebonden op membraan, hybridiseren met gelabeld target (analoog aan LiPA en AMPLICOR)

16 ASO

17 ASO

18 Oligonucleotide ligation assay OLA
Test voor gekende punt mutaties of polymorfismen Gebaseerd op ligeren van twee probes indien complete complementariteit Gebruik DNA-ligasen: rTth, T4 DNA ligase Testen voor 31 gekende mutaties in één enkele analyse Flourescent gelabelde probes met laser fluorescentie detectie

19 Oligonucleotide ligation assay OLA

20 Fluorescente labels FAM HEX TET
Pentaethylene oxide eenheden Fluorescente labels FAM HEX TET Voor elke label (aantal common probes) moet IEDERE selectieve probe een verschillende lengte hebben

21 Oligonucleotide ligation assay OLA

22 In situ amplificatie (In situ PCR)
PCR in gefixeerde weefsels of cellen, correleren van PCR reultaat naar morfolgie Gevoeliger dan in situ hybridizatie ISH Cel voldoende permeabiliseren voor PCR reagentia, doch voldoende intact om PCR producten te behouden Studie van gen expressie en mutaties in abnormale cellen of weefsels

23 In situ amplificatie (In situ PCR)
Proteinase K Formalin paraformaldehyde Denhardt’s solution

24 Southern blotting Ook ASO probe mogelijk Ook niet radio-
Actieve labeling mogelijk

25 RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism
Gebruikt southern blotting Typeren van mutaties die een restrictie-site veranderen en grote inserties of deleties tussen restrictie-sites Ook voor genotypische klassificatie van virussen

26 RFLP Detectie met DNA-probe specifiek voor b-globine gen
GEEN ASO-probe

27 Restriction mapping Gebruikt ook Southern blotting
Detecteerd gen-deleties, met intragene DNA-probe (probe tegen sekwentie in het gen) Kleine deleties (100 tal basen) korter fragment Grote deleties geen fragment indien homozygoot, heterozygoot minder intens ten opzichte van andere fragmenten Vb 21-hydroxylase deficiency (deficientie in cortisol en aldosteron productie)

28 Restriction mapping Pseudogenen Functionele genen 1 2 1 1

29 Northern blotting Variant van Southern waarbij het target RNA is ipv DNA Studie van expressie patroon van een gekloond gen in verschillende weefsels Geen restrictie enzymen nodig

30 Northern blotting