Regulation of calcium-sensing receptor by amyloid-beta-42: implications for Alzheimer’s disease  2ste Master Biomedische Wetenschappen Jabar Zada Freba.

Presentatie over: "Regulation of calcium-sensing receptor by amyloid-beta-42: implications for Alzheimer’s disease  2ste Master Biomedische Wetenschappen Jabar Zada Freba."— Transcript van de presentatie:

1 Regulation of calcium-sensing receptor by amyloid-beta-42: implications for Alzheimer’s disease  2ste Master Biomedische Wetenschappen Jabar Zada Freba   Academiejaar: 2012 – Promotor: Prof. Dr. K. D’Herde Co-promotor: Dr. A. Diez Fraile Goeiemorgen iedereen, mijn naam is Jabar Zada Freba, studente van 2de master in Biomedische wetenschappen. Ik zal het in de komende tien minuten hebben over de regulatie van calcium-sensing receptor door amyloid-beta-42 en de implicaties ervan voor de ziekte van Alzheimer

2 Overzicht Probleemstelling Hypothese Materiaal en methode
Resultaten en discussie Conclusies Hierbij geef ik een korte overzicht van wat ik zal bespreken. Ik zal beginnen met het inkaderen van de probleemstelling en hypothese. Daarna zal ik het hebben over de resultaten, discussie en de uiteindelijke conclusies

3 Probleemstelling De ziekte van Alzheimer Neurodegeneratief
Microscopisch: tau-eiwit kluwens amyloid-β plaques Verhoogde secretie van Amyloid-β (Aβ) peptide Alzheimer is een neurodegeneratieve aandoening, gekenmerkt door graduele geheugenverlies. Op microscopisch niveau ziet men tau-eiwit kluwens in de neuronen en seniele plaques tussen de neuronen. Deze plaques ontstaan door een verhoogde secretie van amyloid beta peptide. Bovendien zorgt AB peptide voor overmatige stimulatie van astrocyten. Deze secreteren op hun beurt pro-inflammatoire mediatoren onder andere interleukine 1beta, iNOS en tumor necrosis factor alfa. Deze moleculen kunnen dan zowel de werking van neuronen als astrocyten beinvloeden. Het mechanisme verloopt in een vicieuze cirkel. Vicieuze cirkel

4 Probleemstelling De pathogenese van Alzheimer Oorzaak?
Stoornis in calcium homeostase Calcium-sensing receptor (CaSR) Amyloid-β een agonist van CaSR GPCR wijdverspreid in het CZS De oorzaak van Alzheimer is nog niet volledig opgehelderd. Er is één hypothese dat bij de ziekte van Alzheimer een stoornis in calcium homeostase optreedt. Dus mechanismen verantwoordelijk voor het behoud van intracellulaire calcium zoals CaSR kunnen een belangrijke rol spelen bij de pathogenese van Alzheimer. Bovendien is het recent gerapporteerd dat amyloid-beta als een agonist van calcium-sensing receptor werkt. CaSR is een G-eiwit gekoppelde receptor die wijdverspreid voorkomt in het CZS. Deze receptor wordt geactiveerd door polycationen, calcimimetics, L-aminozuren

5 2. Hypothese CaSR is betrokken in Aβ42 gemedieerde activatie van astrocyten. Bij deze studie stelden we ons de vraag of de activatie van astrocyten gemedieerd wordt door binding van amyloid-beta op CaSR.

6 3. Materialen en methoden
Celcultuur NHA = Normale Humane Astrocyten Reagentia Oligomere humane Aβ42 (1-20µM; 6 &12h) CaSR agonist, NPS-R-568 (0,1-10µM; 6&12h) Methoden Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) Immunocytochemie F-actine kleuring RT-qPCR Om deze hypothese te bestuderen, hebben we gewerkt met normale humane astrocyten. Voor het onderzoeken van de activatie van NHA cellen, hebben we deze cellen gekweekt tot passage 7 en daarna geïncubeerd met verschillende concentraties van AB42 of NPS-R-568. Nadien hebben we een deel van de cellen gefixeerd voor F-actine kleuring en een deel gecollecteerd voor de RT-PCR. Dit gebeurde na 6 en12h incubatietijd.

7 4. Resultaten 1. Transmissie-electronenmicroscopie
NHA cellijn weinig gekend Karakteristatie van NHA subculturen Glycogeen opstapeling Geëlongeerde mitochondriën Cytoplasmatische extensies Gecoate Vesikels en caveolae Gap juncties  Astrocyten Aangezien de NHA cellijn weinig gekend is in de literatuur, zijn we eerst op basis van Transmissie elektronenmicroscopie op zoek gegaan naar de karakteristieken van deze cellen. Hierbij hebben we een verzameling van kenmerken kunnen visualizeren die tesamen typerend zijn voor astrocyten. er is glycogeen opstapeling, geëlongeerde mitochondrien, cytoplasmatische extensie. Bovendien zijn er gecoate vesikels en caveolae aanwezig op de plasmamembraan wat ook zeer typerend is voor de astrocyten Hieruit konden we concluderen dat de NHA subculturen ultrastructurele kenmerken van astrocyten vertonen.

8 4. Resultaten 2. Immunocytochemie CaSR Kern
Daarna hebben we de expressie van CaSR op de NHA subculturen geëvalueerd op basis van immunocytochemie. Links zien we de niet-gepermeabiliseerde cellen, waarbij de expressie van CaSR op de plasmamembraan te zien is. Rechts zien we de gepermeabiliseerde cellen waarbij een intracellulaire pool van CaSR aanwezig is waardoor een hoger immunofluorescentie te zien is Dus hiermee hebben we bevestigd dat de NHA cellen CaSR expresseren. Hoewel we de mRNA niet konden detecteren met RT-qPCR Niet-gepermeabiliseerd Gepermeabiliseerd

9 4. Resultaten 3. Aβ42-gemedieerde activatie van astrocyten Controle
Het is wel gekend in de literatuur dat er bij AB-gemedieerde activatie van astrocyten een morfologische wijziging optreedt. Met de morfologische wijziging bedoelen we dat de astrocyten bij activatie stervormig worden en een afgeronde cellichaam met dunne uitlopers vertonen. We hebben onderzocht of dit ook het geval is bij de NHA cellen Cortical astrocyte cultures were prepared from neonatal 1–2 day old. Sprague–Dawley rats Waarom met F-actine kleuring gedaan als je het toch met fase contrast kon visualiseren? Hu J, Akama KT, Krafft GA, Chromy BA, Van Eldik LJ (1998). Amyloid-beta peptide activates cultured astrocytes: morphological alterations, cytokine induction and nitric oxide release. Brain research 785:

10 4. Resultaten 3.1. F-actine kleuring en DAPI 6h amyloïd-β-42
Geen geactiveerde morfologie te zien Bij F-actine kleuring konden we geen verschil zien tussen de controle en de AB behandelde cellen. Bovendien de typische morfologie van reactieve astrocyten was niet te zien bij de behandelde cellen. Er is geen de visu verschil te zien tussen de verschillende concentraties van AB. Zelfs na langere incubatietijden zagen we geen effect van amyloid beta tov controle. Zoals u hier ook kunt zien, ook met de specifieke agonist konden we geen activatie van de NHA cellen waarnemen. Dus hieruit concludeerden we dat er de visu geen reactieve morfologie te zien is bij de NHA cellen na behandeling met AB of CaSR-agonist

11 4. Resultaten 3.2. Evaluatie van iNOS, TNF-α en IL-1β door RT-qPCR
Geen detectie van iNOS en TNF-α Lichte upregulatie van IL-1β na 6 h incubatie met 1 µM Aβ42 Naast de evaluatie van morfologische wijziging zijn we via RT-PCR op zoek gegaan naar mRNA van pro-inflammatoire moleculen die gesecreteerd worden bij AB-gemedieerde activatie van astrocyten. De mRNA van iNOS en TNF-alfa werd niet gedetecteerd maar er was een lichte stijging te zien in IL-1b na 6u incubatie met 1 µM AB42 bij twee van de drie experimenten. Maar er is een grote variatie tussen de drie experimenten Uit deze resultaten bleek dat de astrocyten geactiveerd werden noch door AB noch door agonist  dit leidde ons tot het onderzoeken van mogelijke valkuilen in ons onderzoeksprotocol. Amyloid-beta-42 NPS-R-568

12 4. Resultaten 4. Evaluatie van mogelijke valkuilen
Oligomere vorm van Aβ42? Negatieve kleuring en TEM GFAP (Glial Fibrillary Acidic protein)-kleuring fibrillair oligomeer Eerst zijn we nagegaan of dat we met de juiste vorm van Amyloid beta hebben gewerkt. Hiervoor hebben we een negatieve kleuring uitgevoerd op de gebruikte AB-oplossing. Het bleek dat we idd de juiste namelijke de oligomere vorm hebben (verwijs naar foto, grijze bollen) Daarnaast hebben we een GFAP kleuring uitgevoerd op NHA cellen omdat GFAP een belangrijke merker wordt geacht voor de astrocyten. De NHA subculturen waren niet GFAP positief. Well known most astrocyte cultures are GFAP positive, we checked whether our cells were also positive but they were negative When they are not GFAP negative it seems they are less reactive Ahmed M, Davis J, Aucoin D, et al (2007) Structural conversion of neurotoxic amyloid-beta(1-42) oligomers to fibrils. Nat Struct Mol Biol. 17:

13 5. Conclusie Astrocyten: ultrastructurele kenmerken CaSR expressie
geen dosis- en tijdsafhankelijke morfologische activatie na incubatie met Aβ42 of NPS-R-568 Geen verhoogde productie van onderzochte pro-inflammatoire moleculen Aβ42 juist geaggregeerd GFAP negatief Ondanks de aanwezigheid van CaSR geen activatie van NHA door Aβ42 of NPS-R-568 waargenemen. Hypothese: Mogelijks hebben de GFAP negatieve astrocyten een verlaagde responsiviteit aan Aβ42. Uit onze onderzoek bleek dat ondanks de aanwezigheid van CaSR op de NHA cellen, geen activatie optreedt bij incubatie met AB42 of de NPS-R-568. Er zijn verdere studies nodig om de rol van CaSR in AB-gemedieerde astrocytenactivatie te bepalen in GFAP positieve cellen. Ik hoop dat we met deze studie een kleine bijdrage kunnen hebben aan het onderzoek rond Alzheimer. Bedankt voor uw aandacht

14 Bedankt voor uw aandacht !
Vragen? Zo ik hoop dat we met deze studie een kleine bijdrage kunnen leveren aan het onderzoek rond de Ziekte van Alzheimer. Ik wil mijn begeleidster en mijn promotor bedanken. Zo dit was mijn voorstelling. Bedankt voor uw aandacht! Zijn er vragen?