Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen

Presentatie over: "Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen"— Transcript van de presentatie:

1 Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen
HB101 (Herbert Boyer) supE44 hsdS20(rB- mB-) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 Een hybride stam ontstaan door een kruising tussen een E. coli K12 x E.coli B kruising. Een amber-suppressor. Oorspronkelijk gebruikt voor grootschalige plasmideproductie en “efficiente” transformatie. RR1 : is een recA+ derivaat van HB101 c1778 dap (deficient in synthese van diaminopimelinezuur, essentieel voor peptidoglycaanopbouw) DH1 (Doug Hanahan) DH5 DH5a DH10 DH10B JM101 (Joachim Messing) supE thi D(lac-proAB) F’ (traD36 proAB+ lacIq lacZDM15) (JM103) TG1 (Toby Gibson) Een EcoK- derivaat van JM101 (noch restrictie, noch modificatie) TG2 Een recombinatie-deficient derivaat van TG1.

2 Strain Information E. coli K-12 MG1655 Description Genotype: F- lambda- ilvG rfb-50 rph-1 Serotype: OR:H48:K- This strain was sequenced by the Blattner laboratory because it approximates wild-type E. coli and "has been maintained as a laboratory strain with minimal genetic manipulation, having only been cured of the temperate bacteriophage lambda and F plasmid by means of ultraviolet light and acridine orange, respectively." (Blattner, et al. 1997). The mutations listed in the genotype are present in most K-12 strains and were probably acquired early in the history of the laboratory strain. - A frameshift at the end of rph results in decreased pyrE expression and a mild pyrimidine starvation, such that the strain grows 10 to 15% more slowly in pyrimidine-free medium than in medium containing uracil. - The ilvG mutation is a frameshift that knocks out acetohydroxy acid synthase II. - The rfb-50 mutation is an IS5 insertion that results in the absence of O-antigen synthesis. MG1655 was derived and named by Mark Guyer from strain W1485, which was derived in Joshua Lederberg's lab from a stab-culture descendant of the original K-12 isolate. This original E. coli strain K-12 was obtained from a stool sample of a diphtheria patient in Palo Alto, CA in 1922.

3 belangrijke elementen in deze stappen :
MG , volledige genoomsequentie van E.coli K12 (Blattner et al.) MC1061 startpunt van Doug Hanahan voor de constructie van DH1 en verder tot DH10B belangrijke elementen in deze stappen : recA1 : verbeteren van de kloonstabiliteit (homologe recombinatie verhinderen) endA1 : inactiveert de codering van het periplasmatisch DNA-specifieke endonuclease => verhoogt de DNA stabiliteit tijdens transformatie een defectief f80 faag met lacZDM15 voor screening door a-complementatie een deoR mutatie zou aanwezig zijn die verhoogde transformatie-efficiëntie geeft, maar dit blijkt nu op een foute interpretatie te berusten. (er blijken nu 52 kandidaat-gemuteerde-genen te zijn potentieel verantwoordelijk voor dit interessante fenotype) DH10 DH10B : na Tn10 insertie (in mdoB) werd met 2-carboxyl, 5-butyl pyridine (5-butyl picoline of ‘fusaric acid’ : heeft antivirale eigenschappen) de TcR (van het Tn10) tegengeselecteerd (i.a.v. een plasmide dat recA tot expressie bracht, en nadien verwijderd werd). Met het verwijderen van de Tn10 merker werd in het isolaat DH10B het flankerende DNA met de MDRS loci gedeleteerd (mrr, mcrA, mcrB, mcrC). Dit verhoogt de efficientie van klonering van zoogdier DNA, waarin cytosine vaak gemethyleerd is. D10B tonA : spontane mutant die werd geselecteerd. tonA geeft resistentie tegen de fagen T1, T5 en f80. Is commercieel verkrijgbaar (Invitrogen NV)

4 DeoR : proteine met Mr = repressor van deo operon (betrokken bij het nucleoside catabolisme)

5 De co-lineariteit tussen MG1655 en DH10B is behoorlijk, maar wat vooral
opvalt is de veel hogere mutatiesnelheid in DH10B. De mutatiesnelheid van DH10B is 13,5 maal hoger t.o.v. MG1655. Dit blijkt echter niet te wijten aan puntmutaties, noch aan deleties, maar aan IS-elementen, voornamelijk IS150. Er zijn 226 gemuteerde genen in DH10B tegenover MG1655, vooral als gevolg van de genetische manipulaties (transducties). Er is enige “remodelling” van de genoomarchitectuur, o.a. een bp tandem herhaling. DH10B is een Leu-auxotroof (deletie van leuLABCD) : groeit op minimaal medium alleen i.a.v. leucine. De groeisnelheid is lichtjes trager dan van de wild-type stam.

6 Meestal transductie met faag P1 vanuit E.coli K12 stammen,
behalve met D7091F die een E.coli B stam is.

7

8

9

10

11

12

13

14

15 De basesamenstelling doorheen het genoom is niet random.
De "G-C skew" (d.i. de verhouding G-C/G+C) is uitgezet als een 10-kb venstergemiddelde voor een van de strengen van het ganse genoom. De skews zijn uitgesplitst voor de 3 codonposities (lijn 1, 2 en 3), voor alle posities samen (lijn 4), voor de linksgerichte genen (lijn 5), de rechtsgerichte genen (lijn 7) en de niet-eiwitcoderende gebieden (lijn 6). De twee verticale lijnen geven de positie van ori aan (in de buurt van bp ) en van replicatieterminatie (in de buurt van bp ).

16