Genklonering Presentatie titel Cursus GKL11 Les2: kloneervectoren Rotterdam, 00 januari 2007 Rotterdam, september 2011

Samenstelling van een PCR reactiemix NEB catalogus 2011.12 p 271 Template DNA Primers Buffer Mg2+ dNTPs DNA polymerase

Cyclus in een PCR reactie Denaturatie Annealing Elongatie

Controles bij een PCR Positieve controle: bewijs dat alle materialen werkzaam zijn en correct zijn gebruikt. Dus: een reactie waarin een vooraf bekend product gevormd moet worden (liefst met dezelfde primers) Negatieve controle: bewijs dat een product daadwerkelijk afkomstig is van de toegevoegde primers en ook het gen van interesse is Dus : PCR zonder DNA (controle op DNA besmetting) of met DNA van een deletiemutant (controle op a-specifieke binding van primers Grootte van het PCR fragment

Samenstelling van een RE reactiemix NEB catalogus 2011.12 p … Juiste buffer Temperatuur Glycerol concentratie Ster activiteit Dubbel-digesten

“Kloneervectoren” Alleen bedoeld om een DNA fragment te “vangen”, vermeerderen, en/of geschikt te maken voor verdere subklonering in een andere vector Ontworpen voor gebruik in E.coli (K12) Afgeleid van natuurlijke plasmiden

Natuurlijke plasmiden Codeert voor antibiotica-resistentie, bacteriocine-productie, toxine productie ori: Replicatie (uni-directioneel) en copy-nr rep-varianten oriV voor replicatie oriT is origin of transfer (conjugatie) tra: conjugatie genen (F-factor) mob: mobiliseerbaarheid in aanwezigheid van een F-factor par: partitie: gelijke verdeling van plasmide kopieën tussen de dochtercellen

Natuurlijke plasmiden S. N. Cohen, J. Bacteriol. 132, 724-737 (1977) http://www.biovisualtech.com

The ColE1 origin of replication Rop eiwit stabiliseert RNAI/RNAII helix , remt zo de replicatie en beperkt daarmee het aantal plasmide kopieën per cel (copy-number)

Natuurlijke plasmiden: extra voorbeeld ter illustratie Guillermo de la Cueva-Méndez & Belén Pimentel EMBO reports (2007) 8, 458 - 464

Een klassieke kloneervector: ca 20/cel NEB cat. p371 bla gen: : beta-lactamase uit Gram-neg. transposon Tn3; expressie geeft AmpicillineR en maakt selectie van plasmide-bevattende bacteriën mogelijk tet gen: pomp uit pSCI01 geeft TetracyclineR en maakt selectie van plasmide-bevattende bacteriën mogelijk rep:replicon (in de betekenis van ori) uit MB1 rop gen:Rop eiwit remt replicatie en beperkt daarmee het aantal plasmide kopieën per cel (copy-number): uit MB1 http://www.bioxtal.com/mappbr.php

Een klassieke kloneervector: >200 / cel NEB cat. p380 rop gen verwijderd en RNAI gemuteerd waardoor RNAI-RNAII hybride nog instabieler is: hierdoor hoger copy-number

MCS van pUC18/19

Alfa-complementatie Dus …….

Alfa-complementatie Dus …….

Alfa-complementatie Dus alfa complementatie werkt alleen in afwezigheid van wild-type lacZ !!!

Bacteriofaag als kloneervector: M13 NEB cat. p370 Dna wordt enkelstrengs ingepakt in virusdeeltje

Bacteriofaag als kloneervector: M13 NEB cat. p370 Dna wordt enkelstrengs ingepakt in virusdeeltje

Alternatief voor insertie-detectie: insertie-selectie met CcdB www.invitrogen.com

CcdA en CcdB zijn anti-toxine/toxine koppel in het E.coli F-plasmide

TOPO cloning Topo I van Vaccinia virus knipt na CCCTT, in één streng Het enzym blijft gekoppeld aan het DNA, tot dat het twee strengen weer ligeert InVitrogen

Natuurlijke plasmiden Incompatibele plasmiden remmen elkaars replicatie Verschillende plasmiden uit eenzelfde incompatibiliteitsgroep (bijv. IncQ) kunnen niet tegelijk in één bacteriecel repliceren Broad-host-range plasmiden kunnen repliceren in verschillende geslachten. Bijv. IncP plasmiden (veel in Pseudomonas)

Hoe kies je geschikte RE’s voor subklonering ? Maak een lijst met RE’s die NIET in je gen knippen Maak een lijst met RE’s die uniek zijn in de vector Beslis of je de orientatie van je insert wil sturen Kijk welke twee enzymen in dezelfde buffer actief zijn Kijk welke RE’s het goedkoopst zijn Geen opties? Kijk naar compatibele overhangs (zie NEB catalogus) Oefening: nodC gen uit Sinorhizobium meliloti kloneren in pUC19

Deelopdracht 2 Zie med.hro.nl/kamse GKL11 2011-2012

Deelopdracht 3 Geef een plasmide-kaart van de vector pCR2.1 en Beschrijf voor ieder plasmide element: Wat de volledige naam en afkorting van het element is, Wat dit element doet en waarom dit nodig of nuttig is (wat gaat er fout of is niet meer mogelijk als het element er niet in zou zitten?), Uit welk organisme het element afkomstig is