Expressie van het DNA De translatie vindt plaats in het cytoplasma.

Translatie In een cel zijn op een willekeurig moment duizenden eiwitten nodig. Die eiwitten moeten allemaal naar een specifieke plaats worden getransporteerd (protein targeting/ ER en golgi-apparaat) In 5 seconden is een eiwit van 100 aminozuren gemaakt.

Translatie De eiwitten worden afgebroken zodra ze niet meer nodig zijn zodat de aminozuren kunnen worden hergebruikt. Er zijn 70 ribosomale eiwitten bij betrokken en een aantal rRNAs. De rRNAs worden gemaakt in de nucleolus. Daar worden ook de ribosomen samengesteld.

Translatie 32 tRNAs om de 20 verschillende aminozuren naar de ribosomen te brengen. Aan de 3’-kant wordt het aminozuur gebonden. De binding van het tRNA aan het mRNA is ook weer antiparallel. De tripletcode van het tRNA is het anticodon. Er zijn 64 codes, waarvan 61 codons voor aminozuren.

32 tRNAs voor 20 aminozuren en 61 tripletcodes. Amino-acyl tRNA synthetases zijn verantwoordelijk voor de binding van de aminozuren aan de 3’-kant van de tRNAs. Een aantal tRNAs kunnen aan meerdere codon’s binden........ door de wobble hypothese.

De wobble hypothese De eerste twee nucleotiden van het codon zijn het belangrijkste voor de binding met anticodon. Bij de meeste aminozuren met meerdere tripletcodes verschilt (alleen) het derde nucleotide. 1 tRNA blijkt aan meerdere codons te kunnen binden (het anticodon begint dan met een I (inosine)).

Wobble hypothese; Inosine

De wobble hypothese Behalve Inosine zijn er nog meer mogelijkheden voor de (afwijkende) binding van anticodon met het codon. De binding is in een aantal gevallen minder sterk dan de A-T en de C-G binding; dit maakt een hoge synthese- snelheid mogelijk.

Is de genetische code echt universeel?

De translatie Waar en hoe start het translatie proces? Initiatie codon Initiator tRNA Shine Dalgarno sequentie Het scanning model De Kozak sequentie ribosoombindingsplaats

Translatie in prokaryoten De ribosoombindingsplaats bevat de Shine Dalgarno sequentie en het startcodon. M.b.v. initiator factoren bindt de kleine subeenheid aan het mRNA en bindt het initiator tRNA met fMET. (Voor de interne methionine codons is er een ander tRNA).

Translatie; enkele verschillen tussen een pro- en een eukaryoot. In een prokaryoot : gekoppelde transcriptie-translatie Mono- en polycistronische mRNAs Operons Geen processing

Translatie in eukaryoten In eukaryoten wordt de ribosoombindingsplaats gevormd door de 5’-Capstructuur of door een interne site (IRES) Vaak start de binding van de betrokken eiwitten bij de 5’-Cap structuur en wordt er gescand tot de eerste AUG is gevonden (het scanning model).

De opbouw van een eukaryotisch mRNA Polyadenylation signal Protein-coding segment 5 3 G P P P AAUAAA AAA … AAA 5 Cap 5 UTR Start codon Stop codon 3 UTR Poly-A tail Figure 17.9 RNA processing: addition of the 5 cap and poly-A tail

Begin translatie in eukaryoten De Kozak sequentie geeft de startplaats van de translatie aan (gcc)gccRccAUG.... Hoe meer de sequentie van het mRNA lijkt op de concensus des te sterker is de translatie.

Na de translatie Na de translatie vinden nog allerlei posttranslationele processen op: Glycosylering, fosforylering, methylering, acetylering,... Toevoegen metaalionen …. frameshift

Kloneren Als je gekloneerd eukaryotisch DNA in een prokaryotische cel tot expressie wil laten brengen moet je met veel factoren rekening houden; Naast alles wat hiervoor is genoemd moet ook rekening worden gehouden met het leesraam (ORF).

Expressie vectoren Een expressie vector wordt gebruikt als het gekloneerde DNA in getransformeerde cellen tot expressie moet komen. De promotor kan daarbij constitutief of induceerbaar (heat shock promotor of IPTG) zijn. Om de expressie te bestuderen kunnen er fusie-eiwitten worden gemaakt of kan er gebruik gemaakt worden van Epitope-tagged proteins

Fusie-eiwitten Door het leesraam van het gekloneerde DNA aan te laten sluiten aan bv. het luciferase gen ontstaat een fusie-eiwit. Het Luciferase gen functioneert als reporter ipv als selectie-marker.

Hoe analyseer je zo’n recombinant plasmide?? Digestie gevolgd door agarose electroforese Southern blot Sequencen (evt. na PCR-en) Expressie bekijken

Epitope tagging Een epitoop is een deel van een macromolecuul waar een antilichaam tegen gevormd kan worden. De 6 histidines van de His-tag vormen een epitoop die specifiek kan worden aangetoond. De tag zit gefuseerd aan het gekloneerde eiwit.

Veel gebruikte eiwit-tags De aangebrachte tags kunnen gebruikt worden om het recombinant eiwit aan te tonen, te isoleren en/ of te zuiveren. BV. eiwitten met de His-tag eraan kunnen worden geïsoleerd doordat de His-tag aan Ni2+ - ionen bindt.

Isolatie van ge-tagde eiwitten Het fusie-eiwit heeft Glutathion transferase als tag. Dat bindt specifiek aan Glutathion.

Isolatie en zuivering mbv eiwit-tags. Na de isolatie kan het eiwit gedetecteerd worden na electroforese gevolgd door Western blotting en immunoprecipitatie.

Eiwit electroforese en Westernblotting

Hoe haal je de juiste kloon uit de bank als de eiwit-sequentie bekend is? Probe Primers voor PCR