From Gene to Protein (CHMBCM21) College 2, CHMBCM21 Eddy van der Linden

“one gene-one polypeptide hypothesis” 17 From Gene to Protein Hoe kan de nucleotidevolgorde van een bepaald gen er voor zorgen dat een individu bepaalde eigenschappen heeft? DNA RNA Protein Doordat dit DNA de synthese van eiwitten en RNA moleculen, die bij eiwitsynthese betrokken zijn, dicteert “one gene-one polypeptide hypothesis” Eiwitten zijn dus de link tussen genotype en fenotype

17 From Gene to Protein Transcriptie: Net als bij replicatie wordt DNA als mal gebruikt voor het verzamelen van de juiste RNA nucleotiden in de juiste volgorde. Dit type RNA heet messenger RNA (mRNA) omdat het de genetische boodschap van DNA overdraagt aan de eiwit producerende ribosomen waar de translatie plaatsvindt. Transcriptie: Het primaire transcript heet bij eukaryoten pre-mRNA omdat het daarna nog op meerdere manieren wordt gemodificeerd tot functioneel mRNA dat naar het cytoplasma wordt getransporteerd waar de translatie plaatsvindt. Tranlatie: Informatie van mRNA wordt gebruikt voor de synthese van een polypeptide. Hierbij vindt de vertaling plaats van de nucleotide sequentie van het mRNA naar de aminozuur sequentie van een polypeptide. Centrale dogma: Stroom van informatie in een cel loopt altijd vanuit DNA via RNA richting eiwit en nooit andersom.

17 From Gene to Protein DNA en RNA zijn chemisch vrijwel identiek aan elkaar: Cytosine (C) Thymine (T) (DNA) Uracil (U) (RNA) Adenine (A) Guanine (G) RNA bevat ribose i.p.v. deoxyribose als suiker RNA bevat als een van zijn basen uracil i.p.v. thymine RNA is meestal opgebouwd uit 1 strand Deoxyribose (DNA) Ribose (RNA)

2 verschillen RNA en DNA

17 From Gene to Protein Transcriptie: Voor ieder gen is één van de twee strands de template (template strand) Voor ieder gen is dus altijd dezelfde strand de template strand maar voor een ander gen kan de andere strand bijvoorbeeld de template strand zijn. Transcriptie: mRNA is complementair aan template strand waardoor de andere strand vaak net als mRNA zelf coding strand wordt genoemd. mRNA wordt van 5’ → 3’ geschreven tijdens transcriptie en ook van 5’ → 3’ afgelezen tijdens translatie. De mRNA tripletten worden codons genoemd. Zo’n codon bepaald welk aminozuur moet worden ingebouwd op de corresponderende positie.

17 From Gene to Protein Translatie: Er zijn 64 verschillende codons, waarvan 61 voor de 20 verschillende aminozuren coderen en 3 als stopcodon dienen. AUG codeert voor methionine maar functioneert tegelijkertijd als startcodon. Polypeptides beginnen dus met methionine, wat er later vaak weer wordt afgeknipt. Codons die voor hetzelfde aminozuur coderen verschillen vaak alleen in de 3e nucleotide base

17 From Gene to Protein RNA polymerase: Splitst beide DNA strands en voegt zonder een primer nodig te hebben RNA nucleotiden toe waardoor RNA keten wordt verlengd (elongatie) in de 5’ → 3’ richting (downstream). Promotor: Plaats op DNA waar RNA polymerase bindt en waar de initiatie van transcriptie plaatsvindt. Terminator: In bacteriën is dit de DNA sequentie die het signaal geeft voor het beëindigen van de transcriptie. Transcriptie unit: Stukje DNA dat in RNA wordt vertaald. Bacteriën hebben 1 RNA polymerase. Eukaryoten hebben 1 RNA polymerase (RNA pol II) voor de productie van mRNA en 2 anderen die RNA produceren dat niet wordt vertaald in eiwitten.

17 From Gene to Protein Initiatie (1): De promotor loopt van het daadwerkelijke startpunt (AUG) tot enkele tientallen nucleotiden upstream. In bacteriën herkent is RNA polymerase zelf in staat om de promotor te herkennen en eraan te binden. Initiatie (2): Bij eukaryoten moet eerst een serie transcriptiefactoren aan de promotor binden voordat RNA pol II in de juiste positie en oriëntatie kan binden. Initiatie (3): Het geheel van RNA pol II en transcriptiefactoren wordt transcriptie initiatiecomplex genoemd. Voor de binding van deze transcriptiefactoren is een cruciale rol weggelegd voor een bepaalde DNA sequentie binnen het promotorgebied die TATA box wordt genoemd.

17 From Gene to Protein Elongatie: RNA pol beweegt langs het DNA template en voegt daarbij complementaire RNA nucleotiden aan het 3’ einde van het groeiende RNA transcript toe. Aan de achterkant van RNA pol wordt het nieuw gevormde RNA weer van het DNA afgetrokken waardoor de dubbele helix met de nontemplate strand weer kan worden gevormd. Terminatie: Bacteriën: Terminator sequentie op DNA zorgt ervoor dat DNA pol van DNA loslaat en daarbij ook het transcript loslaat. Eukaryoten: Eerst vindt transcriptie van de polyadenylering signaal sequentie op DNA plaats (codeert voor polyadenylering signaal AAUAAA in pre-mRNA), waarna (10-35 nucleotiden downstream) eiwitten die met het groeiende transcript zijn verbonden het DNA van de polymerase losknippen waarbij het RNA transcript wordt bevrijd

17 From Gene to Protein * 5’ einde ontvangt 5’ cap die bestaat uit 1 gemodificeerde guanine (G) nucleotide * Aan 3’ einde worden 50-250 extra adenine (A) nucleotiden toegevoegd (poly-A staart) Deze modificaties faciliteren export mRNA uit nucleus en de binding van ribosomen aan 5’ einde mRNA. Ook beschermen deze modificaties mRNA tegen degradatie door hydrolytische enzymen. * Splicing: De DNA sequentie die codeert voor een polypeptide is meestal opgesplitst in verschillende segmenten (exons) die worden ondrbroken door grote stukken noncoderend DNA (introns). Deze introns worden aanvankelijk (pre-mRNA) gewoon gesynthetiseerd maar worden vervolgens (mRNA)door zogenaamde spliceozomen verwijderd.

Capping van het 5`-uiteinde Bij “capping” wordt een nucleotide achterstevoren aan het 5’-uiteinde van de eerste nt van het mRNA gebonden. Hieronder is dat in detail te zien. Functie = ..............

Opbouw eukaryotisch gen

Door mRNA met DNA te hybridiseren kunnen de introns met de EM zichtbaar worden gemaakt. Een schematische weergave is hieronder te zien.

17 From Gene to Protein Small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) herkennen introns aan beide kanten aan korte specifieke nucleotide sequenties. snRNPs zitten in de nucleus van de cel en bestaan uit eiwit en RNA (snRNA). Verschillende snRNPs komen met andere eiwitten samen en vormen een spliceozoom dat het intron verwijdert en de ernaast liggende exons weer samenvoegt.

Splicing is het verwijderen van de introns (niet-coderende stukken DNA) Het splicen wordt (meestal) uitgevoerd door snRNPs= Small nuclear RiboNucleoProteins (Uitspreken als snurps)

Een actieve spliceosoom (met snRNPs) in detail.

17 From Gene to Protein Translatie: Er zijn 64 verschillende codons, waarvan 61 voor de 20 verschillende aminozuren coderen en 3 als stopcodon dienen. AUG codeert voor methionine maar functioneert tegelijkertijd als startcodon. Polypeptides beginnen dus met methionine, wat er later vaak weer wordt afgeknipt. Codons die voor hetzelfde aminozuur coderen verschillen vaak alleen in de 3e nucleotide base

17 From Gene to Protein TRANSLATIE Transfer RNA (tRNA) brengt de aminozuren vanuit het cytoplasma naar de groeiende polypeptide keten in de ribosomen toe, welke ze zo 1 voor 1 aan keten kunnen toevoegen. Elk type tRNA draagt een specifiek aminozuur aan 1 kant en aan de andere kant een specifiek nucleotide triplet (antocodon), die een basepaar kan vormen met het complementaire codon op het mRNA. Wanneer een mRNA molecuul door een ribosoom beweegt zal het juiste aminozuur dus alleen worden toegevoegd wanneer het juiste codon wordt gepresenteerd.

17 From Gene to Protein tRNA is een 80 nucleotide lange RNA strand die zich via H-brug vorming tot een 2D klaverbladstructuur vormt, waarvan alleen 3’ einde en loops voor de verschillende tRNA’s verschillen. Deze 2D structuur vouwt zich tot een L-vormige 3D structuur met anticodon aan 1 kant en het 5’ einde en het 3’ einde waaraan het aminozuur bindt aan de andere kant.

17 From Gene to Protein Aminoacyl-tRNA synthetase: De actieve centra passen slechts op specifieke combinaties van aminozuur en tRNA 64 verschillende triplet combinaties 61 verschillende coderende sequenties 45 verschillende tRNA’s 20 verschillende synthetasen 20 verschillende aminozuren

17 From Gene to Protein De grote en kleine subunit van ribosomen zijn opgebouwd uit eiwit en ribosomaal RNA (rRNA) en komen alleen samen tot een functioneel complex wanneer ze gebonden zijn aan een mRNa molecuul. De P site houdt de tRNA vast die aan de polypeptideketen wordt bevestigd. De A site houdt de tRNA vast waarvan het aminozuur als volgende aan de groeiende polypeptideketen wordt gekoppeld . Ongeladen tRNA’s verlaten vervolgens het ribosoom via de E site.

17 From Gene to Protein Initiatie fase bij bacteriën Initiatie bij eukaryoten: Kleine subunit en initiator tRNA (Met) bindt aan 5’ cap en beweegt downstream tot startcodon wordt bereikt waaraan tRNA via waterstofbruggen aan bindt. Daarna bindt grote subunitwaarmee de vorming van het translatie initiatie complex (en dus de initiatie) is afgerond.

17 From Gene to Protein Elongatie fase van de translatie CODON HERKENNING TRANSLOKATIE VORMING PEPTIDE- BINDING

17 From Gene to Protein Terminatie: Wanneer het stopcodon de A site bereikt bindt een releasefactor i.p.v. een aminoacyl-tRNA aan het mRNA die een watermolecuul i.p.v. een aminozuur doneert waardoor hydrolyse van de tRNA-aminozuur binding optreedt en de polypeptideketen via de exit tunnel het ribosoom verlaat.

17 From Gene to Protein Polyribosomen: Meestal zijn meerdere ribozomen tegelijkertijd eiwit aan het produceren vanuit hetzelfde mRNA molecuul.

17 From Gene to Protein Een N-terminale signaalpeptide zorgt ervoor dat een polypeptideketen de cel uit of een organel in wordt getransporteerd of in het membraan wordt ingebouwd. Wanneer een polypeptideketen in het ER moet zijn wordt de groeiende polypeptideketen met ribosoom en al naar het ER getransporteerd waar de synthese wordt afgemaakt en waarbij de keten via membraan porie door het membraan wordt geduwd.

17 From Gene to Protein Substituties Hetzelfde aminozuur wordt aangemaakt dus is er geen effect op het fenotype. 1 aminozuur verandert. Dit heeft meestal weinig effect op het functioneren van het eiwit maar in sommige gevallen is het effect wel drastisch. Aminozuur codon verandert in stopcodon. Dit leidt In bijna alle gevallen tot non-functioneel eiwit.

17 From Gene to Protein Insertie / Deletie

Het effect van een mutatie op de eiwitsynthese is heel duidelijk te zien bij sickelcel anemie.

Progeria

17 From Gene to Protein Een gen is een gebied op het DNA dat tot expressie kan leiden en waarvan de expressie leidt tot een functioneel produkt in de vorm van een polypeptiden of een RNA molecuul 1 Transcriptie van RNA vindt plaats vanuit DNA template. 4 M.b.v. specifieke enzymen en ATP hecht ieder aminozuur aan bijbehorend tRNA. 2 RNA transcript (pre-mRNA) wordt gesplitst (splicing) en gemodificeerd tot mRNA dat naar cytoplasma wordt getransporteerd. 3 mRNA verlaat cytoplasma en bindt aan ribosoom. 5 Wanneer mRNA door ribosoom wordt bewogen voegen de verschillende tRNA’s één voor één het juiste aminozuur aan de groeiende polypeptideketen toe, waarna polypeptide wordt bevrijd.

21 Noncoding DNA noncoderende RNA’s STR menselijk DNA: 3000 Mb: ˂21000 genen (slecht 1,5% is dus exon), 5% exons en zo’n 20% regulatie Transposable genetic elements: Repetitieve DNA sequenties die zich via recombinatie van de ene naar de andere lokatie binnen het genoom kunnen verplaatsen (“jumping genes”) noncoderende RNA’s STR