Transcriptie (bij pro- en eukaryoten) Splicing, gewoon en alternatief Expressie van het DNA Transcriptie (bij pro- en eukaryoten) Splicing, gewoon en alternatief RNA-editing MicroRNAs

Expressie van het DNA: Transcriptie, processing en translatie

Transcriptie De transcriptie start bij een speciale DNA-sequentie: de Promotor Deze sequentie ligt in de coderende DNA streng. De andere DNA streng (de template streng) wordt als template voor de RNA synthese gebruikt. De synthese wordt uitgevoerd door DNA afhankelijk RNA Polymerase. De Transcriptie wordt gereguleerd. Verschil pro- en eukaryoot. De coderende streng

Transcriptie Coderende streng Het enzym heeft geen 3’ - 5’ exo nuclease activiteit. 1 : 104- 1 : 105 nt is fout. Is dat erg???

E. Coli promotoren E.coli promotors worden herkend door het RNA – polymerase holoenzym (5 subunits) waaraan een 6e subunit, de σ factor is gebonden. σ 70 bindt aan alle “housekeeping” genen. Enkele voorbeelden van promotor sequenties staan hieronder. σ

Het hergebruik van de σ70 –factor

Verschillende σ –factoren De verschillende σ factoren hebben een verschillende specificiteit voor promotoren. Ze hebben allemaal een andere dissociatieconstante en ze komen in verschillende hoeveelheden voor in een cel.

Terminatie van de transcriptie ρ onafhankelijke transcriptie- terminatie door middel van vorming hairpin en de aanwezigheid van een aantal AAA’s in de template streng. De DNA-RNA hybride wordt daardoor erg instabiel, waardoor het RNA van het DNA loslaat. Bij de ρ afhankelijke transcriptie- terminatie speelt het ρ-eiwit een rol bij het verbreken van de binding van het RNA met het DNA (veel meer is er niet over bekend). Terminatie van de transcriptie

Regulatie transcriptie bij prokaryoten Constitutieve expressie Reguleerbare genen; stimulatie of remming Een voorbeeld hiervan is de werking van het Lac-operon; een repressor blokkeert de transcriptie als er geen Lactose in het medium aanwezig is. Een enhancer versterkt de transcriptie.

Transcriptie bij eukaryoten Transcriptie vindt plaats in de kern Er zijn meerdere RNA Polymerases actief Er zijn veel verschillende Transcriptie Factoren (TF’s) De Promotor sequentie is anders dan bij de prokaryoten Na de transcriptie vindt processing plaats.

Eukaryoten hebben 3 soorten RNA polymerases: RNA polymerase I (Pol I): pre-ribosomaal RNA (18S, 5,8S en 28S rRNA) RNA polymerase II (Pol II): mRNA en enkele speciale kleine RNAs RNA polymerase III (Pol III): alle tRNAs, 5S rRNA en enkele andere speciale kleine RNAs Alle gemaakte RNAs bij elkaar vormen het Transcriptoom Alle gesynthetiseerde RNAs worden geprocessed RNA Pol heeft Mg2+ nodig, Zn2+ en dNTPs (en geen primer). Turnover

De Promotor voor RNA Pol II FIGURE 26-9 Common sequences in promoters recognized by eukaryotic RNA polymerase II. The TATA box is the major assembly point for the proteins of the preinitiation complexes of Pol II. The DNA is unwound at the initiator sequence (Inr), and the transcription start site is usually within or very near this sequence. In the Inr consensus sequence shown here, N represents any nucleotide; Y, a pyrimidine nucleotide. Many additional sequences serve as binding sites for a wide variety of proteins that affect the activity of Pol II. These sequences are important in regulating Pol II promoters and vary greatly in type and number, and in general the eukaryotic promoter is much more complex than suggested here (see Figure 15-23). Many of the sequences are located within a few hundred base pairs of the TATA box on the 5′ side; others may be thousands of base pairs away. The sequence elements summarized here are more variable among the Pol II promoters of eukaryotes than among the E. coli promoters (see Figure 26-5). Many Pol II promoters lack a TATA box or a consensus Inr element or both. Additional sequences around the TATA box and downstream (to the right as drawn) of Inr may be recognized by one or more transcription factors. Inr = initiation complex. Y = Py N = alles De transcriptie begint in of vlakbij de Inr sequentie. De regelsequenties kunnen upstream zitten, maar ook honderden nt downstream!!!! Gemeenschappelijke structuren in promotoren die door Pol II worden herkend (versimpelde versie). Inr =

Bij eukaryoten zijn twee groepen transcriptie factoren actief I: De basale transcriptie factoren Deze zijn altijd nodig om de transcriptie te laten starten II: De specifieke transcriptie factoren Deze factoren (eiwitten) zijn vaak specifiek voor een bepaald gen of een bepaalde groep genen Ze verhogen de transcriptie

Enkele voorbeelden van transcriptie-factoren (illustratie). TABLE 26-2 Proteins Required for Initiation of Transcription at the RNA Polymerase II (Pol II) Promoters of Eukaryotes

Voorbeeld start Transcriptie eukaryotisch gen ( om de complexiteit te laten zien) (illustratie). FIGURE 26-10 Transcription at RNA polymerase II promoters. (a) The sequential assembly of TBP (often with TFIIA), TFIIB, TFIIF plus Pol II, TFIIE, and TFIIH results in a closed complex. Within the complex, the DNA is unwound at the Inr region by the helicase activity of TFIIH and perhaps of TFIIE, creating an open complex. The carboxyl-terminal domain of the largest Pol II subunit is phosphorylated by TFIIH, and the polymerase then escapes the promoter and begins transcription. Elongation is accompanied by the release of many transcription factors and is also enhanced by elongation factors (see Table 26-2). After termination, Pol II is released, dephosphorylated, and recycled. (b) Human TBP (gray) bound to DNA (blue and white) (PDB ID 1TGH). (c) A cutaway view of transcription elongation promoted by the Pol II core enzyme. The drawing is based on the structure featured on the cover of this book. Het COOH-uiteinde van Pol II bevat 52 x YSPTSPS

Enhancers of repressors kunnen de transcriptie positief of negatief beïnvloeden (frequentie van initiatie).

De complexiteit van de regulatie van transcriptie bij eukaryoten Transcriptional regulators can each have a different role. Combinations of one, two, or three regulators (blue, green, and yellow shapes) can affect transcription in different ways by differentially affecting a mediator complex (orange), which is also composed of proteins. The effect is that the same gene can be transcribed in multiple ways, depending on the combination, presence, or absence of various transcriptional regulator proteins. © 2010 Nature Education All rights reserved.

Activerende en remmende transcriptiefactoren Er kunnen behalve activatoren ook zg. silencers actief zijn. NB: Terminatie signalen voor Pol II zijn nog niet gevonden.

Processing van pre-mRNA FIGURE 26-12 Formation of the primary transcript and its processing during maturation of mRNA in a eukaryotic cell. The 5′ cap (red) is added before synthesis of the primary transcript is complete. A noncoding sequence (intron) following the last exon is shown in orange. Splicing can occur either before or after the cleavage and polyadenylation steps. All the processes shown here take place in the nucleus.

Processing; de Cap structuur De Cap bestaat uit 7-methylguanosine die aan het 5’ uiteinde wordt gekoppeld via een ongebruikelijke 5’- 5’ binding. FIGURE 26-13a The 5′ cap of mRNA. (a) 7-Methylguanosine (m7G) is joined to the 5′ end of almost all eukaryotic mRNAs in an unusual 5′,5′-triphosphate linkage. Methyl groups (pink) are often found at the 2′ position of the first and second nucleotides. RNAs in yeast cells lack the 2′-methyl groups. The 2′-methyl group on the second nucleotide is generally found only in RNAs from vertebrate cells.

De Capping meer in detail: illustratie!! FIGURE 26-13b The 5′ cap of mRNA. (b) Generation of the 5′ cap involves four to five separate steps (adoHcy is S-adenosylhomocysteine).

splicing Er zijn 4 soorten introns (50 – 20.000bp). Sommige splicen zichzelf (er zijn geen eiwitten bij betrokken). De meeste mRNA’s die in de kern worden gemaakt hebben introns die met de spliceosomen worden verwijderd. De spliceosomen bevatten verschillende snRNPs (small nuclear Ribonucleoproteins). 5 verschillende snRNA’s (U1, 2, 4, 5 en 6) en ± 50 verschillende proteins. De overgang van exon naar intron is altijd een AG/GU en van intron naar exon ook! FIGURE 26-14 Transesterification reaction. Shown here is the first step in the two-step splicing of group I introns. In this example, the 3′ OH of a guanosine molecule acts as nucleophile, attacking the phosphodiester linkage between U and A residues at an exon-intron junction of an mRNA molecule (see Figure 26-15).

Overzicht van de verschillende processing stappen bij mRNA FIGURE 26-19 Overview of the processing of a eukaryotic mRNA. The ovalbumin gene, shown here, has introns A to G and exons 1 to 7 and L (L encodes a signal peptide sequence that targets the protein for export from the cell; see Figure 27-38). About three-quarters of the RNA is removed during processing. Pol II extends the primary transcript well beyond the cleavage and polyadenylation site ("extra RNA") before terminating transcription. Termination signals for Pol II have not yet been defined.

Verdeling introns/ gen (illustratie)

Polyadenylering Aan de 3’-kant van het geproceste RNA worden 80 – 250 A’s geplaatst door het enzym ………. Het 5’ AAUAAA signaal wordt ook wel het poly-adenylerings signaal of het cleavage signaal genoemd. Het RNA transcript wordt 10 – 30 nt’s na dit signaal geknipt, waarna de poly-adenylering plaatsvindt. Na correcte processing gaat het RNA naar het cytoplasma om daar vertaald te worden. FIGURE 26-18 Addition of the poly(A) tail to the primary RNA transcript of eukaryotes. Pol II synthesizes RNA beyond the segment of the transcript containing the cleavage signal sequences, including the highly conserved upstream sequence (5′)AAUAAA. 1 The cleavage signal sequence is bound by an enzyme complex that includes an endonuclease, a polyadenylate polymerase, and several other multisubunit proteins involved in sequence recognition, stimulation of cleavage, and regulation of the length of the poly(A) tail. 2 The RNA is cleaved by the endonuclease at a point 10 to 30 nucleotides 3′ to (downstream of) the sequence AAUAAA. 3 The polyadenylate polymerase synthesizes a poly(A) tail 80 to 250 nucleotides long, beginning at the cleavage site.

Variatie in transcriptie Er zijn ± 30.000 genen in het menselijke genoom waarvan honderden duizenden verschillende eiwitten kunnen worden gemaakt. Dat kan doordat er veel variatie mogelijk is tijdens en na de transcriptie: Alternatief promotor gebruik Alternatief poly-adenylerings signaal Alternatieve splicing RNA editing RNA processing MicroRNA Translationele frameshift NB: Er zijn ook nog genen die 1 transcript opleveren dat wordt vertaald in 1 eiwit.

Alternatief promotor gebruik

Alternatieve polyadenylering In een transcript kunnen meerdere cleavage signalen aanwezig zijn. FIGURE 26-20a Two mechanisms for the alternative processing of complex transcripts in eukaryotes. (a) Alternative cleavage and polyadenylation patterns. Two poly(A) sites, A1 and A2, are shown.

Alternatieve splicing Er zijn in het transcript meerdere 5’- of 3’-splicesites aanwezig, zodat er meerdere mogelijkheden zijn voor het splicen. FIGURE 26-20b Two mechanisms for the alternative processing of complex transcripts in eukaryotes. (b) Alternative splicing patterns. Two different 3′ splice sites are shown. In both mechanisms, different mature mRNAs are produced from the same primary transcript.

Een voorbeeld van weefsleafhankelijke variable splicing FIGURE 26-21 Alternative processing of the calcitonin gene transcript in rats. The primary transcript has two poly(A) sites; one predominates in the brain, the other in the thyroid. In the brain, splicing eliminates the calcitonin exon (exon 4); in the thyroid, this exon is retained. The resulting peptides are processed further to yield the final hormone products: calcitonin-gene-related peptide (CGRP) in the brain and calcitonin in the thyroid.

Een overzicht van de verschillende processing variaties FIGURE 26-22 Summary of splicing patterns. Exons are shown in shades of green, and introns/untranslated regions as yellow lines. Positions where polyadenosine is to be added are marked with asterisks. Exons joined in a particular splicing scheme are linked with black lines. The alternative linkage patterns above and below the transcript lead to the top and bottom spliced mRNA products, respectively. In the products, red and orange boxes represent the 5′ cap and 3′ untranslated regions, respectively.

Wat gebeurt er bij RNA editing?? Bij RNA editing worden 1 of meerdere nucleotiden in het gesynthetiseerde RNA veranderd door het afsplitsen van een amino groep van de stikstofbase of kunnen 1 of meerdere nucleotiden worden toegevoegd (insertie) of verwijderd (deletie). Het resultaat is een andere nucleotide. Inosine wordt vertaald alsof het een G is.

Voorbeeld RNA editing door deaminering

RNA editing ; deletie en/of insertie van nucleotiden In eukaryotische mitochondrien en chloroplasten. Guide-RNA’s G-U baseparing in RNA

Waar komt DNA tot expressie? Chromatine kan meer of minder in elkaar gedraaid zijn. Euchromatine is de minder gecondenseerde vorm van chromatine… deze vorm is actief! Heterochromatine is de meer gecondenseerde vorm van chromatine. Deze vorm is niet actief! Er vindt bv. geen transcriptie plaats!!

Sommige gebieden (telomeren en centromeer) zijn nooit actief. In andere gebieden kan het Chromatine ge-activeerd en ge-inactiveerd worden (van eu-chromatine naar heterochromatine). Hierbij spelen methylatie en acetylatie een belangrijke rol. Methylatie van de nucleotiden, maar ook van de histoneiwitten.

Beinvloeden de histonen de transcriptie? Men ging er altijd van uit dat methylering van DNA de transcriptie van DNA negatief beïnvloedde. Nu blijkt dat er een andere oorzaak moet zijn voor de inactivatie. Methylering is om “per ongeluk” transcriptie te voorkomen. Acetylering van de aa’s van de histonen beinvloedt de stapeling van de nucleosomen!!! Acetylering = activatie van de transcriptie Deacetylering = repressie

Methylering van DNA In DNA worden de A en de C vaker gemethyleerd dan de G en de T. Er zijn zogenaamde CpG gebieden (veel meer CG nucleotiden achter elkaar) waarbij de C vaak gemethyleerd is.

Afbraak van RNA In prokaryoten is de halfwaardetijd van mRNAs slechts enkele minuten. Bij eukaryoten bedraagt dat uren. De “half-life of RNA” kan worden bepaald met de Northern blot methode.

Hoe vindt je de promotor in het DNA? Dit kan worden bepaald met de Footprinting methode.

De Footprint zichtbaar maken Een Footprint van de Lac promotor

Processing van andere RNAs Behalve mRNA worden ook de andere RNAs na transcriptie geprocessed. Na methylering en pseudo-uridine vorming (en nog meer modificaties) vindt er splicing plaats van het pre-rRNA. snoRNP- deeltjes spelen hierbij een belangrijke rol.

Processing tRNA

MicroRNAs (miRNAs) miRNAs spelen een belangrijke rol in genregulatie. Processing van pri-miRNA door Drosha en processing van pre-RNA door Dicer 20 - 25 nucleotiden Complementair aan (delen van) mRNA Door binding aan (3’- UTR van) mRNA wordt het mRNA afgebroken of wordt de translatie geremd = Gene silencing Duizenden miRNAs die ± 30% van de genen reguleert Sommige binden aan 1 mRNA, andere aan meerdere mRNAs siRNAs FIGURE 26-28 Synthesis and processing of miRNAs. The primary transcript of miRNAs is larger RNA of variable length, a pri-miRNA. Much of its processing is mediated by two endoribonucleases in the RNase III family, Drosha and Dicer. First, in the nucleus, the primiRNA is reduced to a 70 to 80 nucleotide precursor miRNA (premiRNA) by a protein complex including Drosha and another protein, DGCR8. The pre-miRNA is then exported to the cytoplasm, where it is acted on by Dicer to produce the nearly mature miRNA paired with a short RNA complement. The complement is removed by an RNA helicase, and the mature miRNA is incorporated into protein complexes, such as the RNA-induced silencing complex (RISC), which then bind a target mRNA. If the complementarity between miRNA and its target is nearly perfect, the target mRNA is cleaved. If the complementarity is only partial, the complex blocks translation of the target mRNA.

Small intereference RNAs (siRNAs) Het miRNA proces kan bij experimenten nagebootst worden: Een klein RNA met hairpin (en complementair aan mRNA) wordt door Dicer herkend en geknipt. Het si-RNA bindt aan mRNA dat daardoor wordt “gesilenced”. Op deze manier kan onderzoek worden gedaan naar het effect van een genproduct zonder in dat gen mutaties aan te hoeven brengen. FIGURE 28-36 Gene silencing by RNA interference. (a) Small temporal RNAs (stRNAs) are generated by Dicer-mediated cleavage of longer precursors that fold to create duplex regions. The stRNAs then bind to mRNAs, leading to degradation of mRNA or inhibition of translation. (b) Double-stranded RNAs can be constructed and introduced into a cell. Dicer processes the duplex RNAs into small interfering RNAs (siRNAs), which interact with the target mRNA. Again, either the mRNA is degraded or translation is inhibited.

Soorten RNAs mRNA codeert voor een eiwit Alle andere RNAs zijn ncRNAs (non-coding RNAs): snRNA snoRNA rRNA tRNA miRNA ………….