BIO 42 Replicatie en PCR “hoe het DNA in een cel wordt verdubbeld”

Replicatie Wanneer wordt het DNA vermenigvuldigd? (Ook wel replicatie genoemd!!) Hoe wordt het DNA vermenigvuldigd? Waar wordt het DNA vermenigvuldigd

Wanneer wordt het DNA vermenigvuldigd??????? Tijdens de interfase wordt alles in de cel voorbereidt voor de volgende celdeling en wordt ook het DNA vermenigvuldigd! Dat laatste gebeurt specifiek in de S-fase!!! Celcyclus

De M-fase wordt onderverdeeld in de Profase, de Metafase, de Anafase en de Telofase. Daarin zijn de chromosomen te zien. B t/m F

Kan je DNA zien??? Het DNA dat in de kernen van een cel zit kan je zien m.b.v. een lichtmicroscoop. Het geïsoleerde DNA kan zichtbaar worden gemaakt m.b.v. agarose gelelectroforese.

Microscopisch beeld (delende) plantencellen interfase profase metafase anafase

Microscopisch beeld (delende) plantencellen interfase In de kernen zijn de nucleoli te zien. Daar vindt de transcriptie plaats van rRNA.

Hoe wordt het DNA vermenigvuldigd?

Semi-conservatieve replicatie Voor de replicatie is een enzym nodig (een eiwit) die het nieuwe DNA maakt. Dit enzym is een DNA polymerase dat voluit DNA afhankelijk DNA polymerase wordt genoemd.

Om de replicatie te kunnen uitvoeren moet de DNA helix (de α helix) worden ontwonden. Dat doet het enzym helicase. Topo-isomerase heeft de ergste draaiing uit de α-helix gehaald. De twee DNA strengen worden in de enkelstrengs vorm gehouden door eiwitten (ss-binding proteins)

DNA polymerase in actie Omdat het DNA Polymerase niet zomaar op een DNA streng (= de matrijs of template) kan beginnen moet er een begin worden gemaakt. Dat gebeurt door het enzym Primase. Deze maakt een primer (= begin). Dit is bij de replicatie altijd een stukje ssRNA. Het stukje RNA eindigt met een 3’-OH uiteinde, waar het DNA polymerase aan kan binden en het kan verlengen met een dNTP.

Synthese (verlenging van) van DNA Het DNA polymerase heeft nodig: matrijs een 3`OH -groep aan een stukje ds DNA en dNTPs. De energie die vrijkomt bij afsplitsing van twee fosfaatgroepen maakt de binding van de nucleotide aan het 3` OH mogelijk. De syntheserichting van DNA is van 5` naar 3` (gezien vanuit de te synthetiseren streng). 3`-OH dNTP

De binding van de nieuwe nucleotide in meer detail Nieuwe covalente band (fosfo- di-ester binding) dNTP dNMP

In de cel komen meerdere vormen van nucleotiden voor: De nucleotiden die in DNA of RNA voorkomen bevatten 1 fosfaatgroep, de zg. dNMPs of NMPs Nucleotiden kunnen ook 2 of 3 fosfaatgroepen bevatten. Dat is aan de afkorting (en de naam ) af te lezen. AMP, ADP, ATP of (Mono, Di of Tri). Aan de afkorting van een nucleotide (dATP/ATP) is af te lezen of het om een nucleotide voor DNA (d) of voor RNA gaat.

Leading en lagging streng ds DNA is opgebouwd uit 2 antiparalelle polynucleotiden. de synthese richting is altijd van 5’→ 3’ is. 1 van de 2 DNA strengen kan van begin tot eind in een continue beweging worden gemaakt….de leading strand De andere streng wordt in stukjes gemaakt; de Okazaki fragmenten

Synthese van leading en lagging streng in meer detail

Elk nieuw stukje DNA start dus met een RNA- primer. Op de leading streng is dat er 1. Op de lagging streng zijn dat er meer. Nadat de DNA-synthese door DNA polymerase III is begonnen, wordt het RNA verwijderd en vervanngen door dNTPs (door DNA pol. I).

Het enzym ligase verbindt uiteindelijk de gaps tussen alle korte fragmenten (=Okazaki fragmenten) met elkaar. Het enzym vormt de covalente band tussen de korte fragmenten (maakt de fosfodiëster binding weer compleet). 5’ 3’

De plaats waar de DNA helix ontwonden wordt door het enzym topo-isomerase en enkelstrengs gemaakt wordt door helicase, wordt de replicatie vork genoemd.

Meerdere functies DNA polymerase

Fouten tijdens de replicatie Tijdens de replicatie worden door het DNA polymerase fouten gemaakt. Dit gebeurt 1 : 10.000 nt’s. Na de “proofreading” van het DNA- polymerase vinden we nog maar 1 : 109 foute nt’s. terug. DNA polymerase blijkt naast de synthese activiteit nog twee andere activiteiten te hebben: Exonuclease van 5’→ 3’ Exonuclease van 3’→ 5’ Op http://chem-faculty.ucsd.edu/kraut/cover.html zie je het DNA polymerase aan het werk.

DNA replicatie start altijd bij een ORI. Een ORI is de origin of replication, een specifieke nt volgorde in het ds DNA. Daar begint de replicatie. Eukaryotisch DNA heeft meerdere ORI’s en dus ook meerdere replicatievorken

DNA replicatie start altijd bij een ORI. Een ORI is de origin of replication, een specifieke nt volgorde in het ds DNA. Daar beginnen de twee replicatie vorken. Het DNA Polymerase herkent m.b.v. 6 andere eiwitten de ORI sequentie.

Bacterieel DNA heeft maar 1 ORI.

De PCR reactie

PCR = Polymerase Chain Reaction Een snelle, (vrij) goedkope, methode waarmee in korte tijd (paar uur) een bepaald stuk DNA (of RNA) in vitro miljoenen keren vermenigvuldigd kan worden. De PCR reactie lijkt erg op de replicatie van DNA.

De PCR reactie werd in 1983 door Kary Mullis ontwikkeld Kary Mullis kreeg voor de ontwikkeling van de PCR in 1993 de Nobelprijs voor Chemie Het idee is simpel: 1: Maak het ds DNA ss 2: Laat op elke streng een primer annealen (binden) (= startpunt voor DNA Polymerase) 3: Laat DNA polymerase de primers verlengen zodat er twee ds DNA strengen ontstaan Herhaal de stappen 1, 2 en 3 20 – 40 x

Per PCR cyclus wordt het DNA een factor 2 vermenigvuldigd. Na 20 cycli is dat….. 220 = 1.048.576 x Na 25 cycli is dat…. 225 = 33.554.432 x De vermenigvuldigingsfactor is onder ideale omstandigheden in principe 2n.

De PCR reactie Het denatureren van het DNA gebeurt bij ± 94 °C, 20 – 30 seconden is vaak al genoeg. De primer annealing vindt meestal plaats bij een temperatuur die tussen de 50 en 60 °C inligt ( De synthese vindt plaats bij 72 °C. De tijdsduur is afhankelijk van de lengte van het te synthetiseren DNA.

Hoe weet je dat de PCR gelukt is?????? Hoe weet je of er een PCR product is gemaakt??? Hoe weet je of dat het correcte product is????? Na de PCR kan een deel van het reactiemengsel in een agarosegel ge-electroforeerd worden.

PCR Voorwaarde om de primers perfect te laten hybridiseren is dat de nt volgorde van het te vermenigvuldigen (stuk) DNA bekend is. Er wordt een speciaal DNA Polymerase gebruikt (Taq Polymerase) afkomstig uit Thermophylus aquaticus dat optimaal werkt bij 75-80 °C.

Bij herhaling van de 3 stappen zijn er dus steeds meer DNA strengen als matrijs beschikbaar!!! - Het gemaakte DNA fragment (PCR product) wordt ookwel amplicon of amplimeer genoemd.

De eerste PCRs die door Kary Mullis werden uitgevoerd waren nog wat “ primitief “ (1) Het epje waarin de PCR werd uitgevoerd werd handmatig van het ene waterbad met een bepaalde temperatuur naar het andere getransporteerd. Nu zijn er apparaten waar het epje in gezet kan worden en waar de temperatuur automatisch veranderd.