Hybridisatie Blotten Probes maken Sequencen Detectiemethoden Hybridisatie Blotten Probes maken Sequencen

Baseparing en hybridisatie Basenparing is de kern van heel veel biologische processen, en dus ook van onderzoekstechnieken. Door de temperatuur sterk te verhogen denatureert het DNA. Temperatuurverlaging geeft renaturatie. Er zijn andere methoden om dsDNA te denatureren: …… maar, verandering van de temperatuur wordt het meest gebruikt. Wanneer het gedenatureerde DNA heel snel wordt afgekoeld blijft het DNA enkelstrengs (bv. na 5’ 94°C direct in ijs plaatsen).

Denaturatie van ds DNA AT baseparen zijn minder sterk dan CG baseparen, vanwege het aantal H-bruggen. De temperatuur waarbij de helft van het DNA ss is, wordt de Tm genoemd, de “melting temperature” (de smelttemperatuur).

De Tm waarde Waar hangt de Tm van af??? De base samenstelling van het DNA De ionen (zout) concentratie van de DNA oplossing De aanwezigheid van organische stoffen Als de ionen concentratie van de DNA oplossing toeneemt neemt ook de Tm toe. dsDNA wordt gestabiliseerd door kationen. Tweewaardige kationen (bv. Mg 2+ ) zijn effectiever dan eenwaardige kationen (K+) Organische stoffen verzwakken de waterstofbruggen waardoor de Tm lager wordt. Een voorbeeld is formamide.

Hoe bepaal je de Tm van DNA??? Met de A260 waarde Door de A260 te meten van een DNA oplossing die geleidelijk wordt verwarmd kan de toename van het enkelstrengs DNA worden gemeten. Dit wordt een uitsmeltcurve genoemd. .

De uitsmeltcurve is afhankelijk van de base samenstelling van het DNA. Voor DNAs met 30 – 70% GC geldt de volgende regel: GC% = 2,44 (Tm – 69,3) Het uitsmelt effect wordt ook wel het hyperchroom effect genoemd. Tm berekenen: Voor korte oligonucleotiden (oligo’s, tot 25 nt’s): Tm=4*(G en C) + 2*(A en T) C

10 °C onder de vastgestelde Tm is alle DNA nog dsDNA 10 °C boven de vastgestelde Tm is alle DNA ssDNA

Hybridisatie Wanneer bij de renaturatie ander ssDNA wordt toegevoegd kan dat ssDNA annealen met complementair DNA. Het maakt daarbij niet uit of het andere DNA dezelfde lengte heeft of niet. De techniek wordt hybridiseren genoemd!!! Bij heteroduplexen is er geen volledige basenparing, dus is de smelttemperatuur lager dan bij homoduplexen van dezelfde DNA’s

Hybridisatie ssDNA kan ook hybridiseren met een stuk (je) RNA (i.p.v. met ssDNA)!! Heteroduplexen Homoduplexen Hybridisatie kan gebruikt worden voor de detectie van specifieke DNA fragmenten, klonen, genen mbv een Probe.

Hybridisatie mbv een probe Een probe is: altijd enkelstrengs DNA of RNA kan een oligonucleotide zijn maar kan ook veel langer zijn. Een probe is altijd voorzien van een label, zodat je kan zien dat er hybridisatie heeft plaatsgevonden. Dat label is bv.: Radio-activiteit 32P, 35S Een Fluorescerende stof (FITC) Een Enzym dat een kleuromzetting laat zien Een Eiwit dat gedetecteerd kan worden door antilichamen (digoxigenine) De fluorescerende stof wordt geactiveerd met een emissie golflengte. De excitatiegolflengte, die je ziet heeft een hogere golflengte (minder energie).

Probe labelen

Kolonie-hybridisatie is een vorm van hybridiseren

Een andere vorm van hybridiseren is de “Southern blot methode” Blotten is het overbrengen van bv. DNA uit een gel (bv. Agarosegel) of poly-acrylamide) op een filter of membraan. Southern blotten = overbrengen DNA Northern blotten = RNA Western blotten = overbrengen eiwit

De Southern blot techniek, gevolgd door hybridisatie met een probe Er zijn veel verschillende manieren om te blotten Hier wordt capillaire werking gebruikt.

Een andere manier van blotten is het electroblotten

Southern blots na hybridisatie In A is de agarose gel te zien die is gebruikt om te blotten. In B, C en D zijn verschillende probes gebruikt.

De Northern blot techniek gevolgd door hybridisatie De Northern blot techniek verschilt in principe niet van de Southern blot techniek. Het belangrijkste punt is dat het moeilijker is RNA te isoleren en intact te laten (RNA breekt veel makkelijker af dan DNA).

Op een Northern blot kun je kwantitatieve (hoeveelheid) eigenschappen meten maar ook kwalitatieve eigenschappen (lengte, splice -varianten). Northern Blot

Enkele voorbeelden van FISH Fluorescentie in situ hybridisatie

Sequencen Sequencen is het vaststellen van de nucleotiden volgorde van DNA. De meest gebruikte techniek is de dideoxy-methode die door Sanger is ontwikkeld in de jaren ’70 (Nobelprijs). Een andere naam is “chain-termination”- methode.

Sequencen = Dideoxy nucleotide Normaal nucleotide voor DNA FIGURE 8-33c DNA sequencing by the Sanger method. This method makes use of the mechanism of DNA synthesis by DNA polymerases (Chapter 25). (c) The DNA to be sequenced is used as the template strand, and a short primer, radioactively or fluorescently labeled, is annealed to it. By addition of small amounts of a single ddNTP, for example ddCTP, to an otherwise normal reaction system, the synthesized strands will be prematurely terminated at some locations where dC normally occurs. Given the excess of dCTP over ddCTP, the chance that the analog will be incorporated whenever a dC is to be added is small. However, ddCTP is present in sufficient amounts to ensure that each new strand has a high probability of acquiring at least one ddC at some point during synthesis. The result is a solution containing a mixture of labeled fragments, each ending with a C residue. Each C residue in the sequence generates a set of fragments of a particular length, such that the different-sized fragments, separated by electrophoresis, reveal the location of C residues. This procedure is repeated separately for each of the four ddNTPs, and the sequence can be read directly from an autoradiogram of the gel. Because shorter DNA fragments migrate faster, the fragments near the bottom of the gel represent the nucleotide positions closest to the primer (the 5′ end), and the sequence is read (in the 5′→3′ direction) from bottom to top. Note that the sequence obtained is that of the strand complementary to the strand being analyzed. = Dideoxy nucleotide Normaal nucleotide voor DNA

De synthese van de nieuwe DNA streng in aanwezigheid van ddGTP geeft bv. bovenstaand resultaat Dezelfde reactie wordt in aparte epjes uitgevoerd op hetzelfde DNA met ddATP, ddCTP en ddTTP

Electroforese na de sequentie-reactie Na de sequentiereacties worden de ds DNAs gedenatureerd en op een poly-acrylamide gel gescheiden.

Sequencen met fluorescerentie-labels In plaats van radio-actieve nucleotiden worden tegenwoordig fluorescerende labels gebruikt die aan de ddNTPs vastzitten. Alle 4 de sequentiereacties kunnen nu in 1 epje plaatsvinden en in 1 laan van een gel ge-electroforeerd worden = capillaire electroforese. FIGURE 8-34 Strategy for automating DNA sequencing reactions. Each dideoxynucleotide used in the Sanger method can be linked to a fluorescent molecule that gives all the fragments terminating in that nucleotide a particular color. All four labeled ddNTPs are added to a single tube. The resulting colored DNA fragments are then separated by size in a single electrophoretic gel contained in a capillary tube (a refinement of gel electrophoresis that allows for faster separations). All fragments of a given length migrate through the capillary gel in a single peak, and the color associated with each peak is detected using a laser beam. The DNA sequence is read by determining the sequence of colors in the peaks as they pass the detector. This information is fed directly to a computer, which determines the sequence.

Rangschikken van clonen in een genomische bank Rangschikken mbv. STS = sequence-tagged site. Dit is een unieke sequentie van 200 – 500 bp (bv. een SSR = simple-sequence repetition) EST = expressed sequence tag Een sequentie van 500 – 800 bp van een gen dat tot expressie komt (Bv. van cDNA). In 2010 waren er 65,9 x 106 bekend. Een verzameling elkaar overlappende clonen is een contig die zijn gerangschikt mbv tags.

Genomics Als de sequentie bekend is kan er een heleboel worden opgezocht: Waar liggen de genen Repeterend DNA Transposons -……. Alle sequenties zijn o.a. opgeslagen in de NCBI data bestanden (zie volgende dia).

Alle chromosomen en het MT DNA zijn bekend. Klik je op het MT DNA dan zie je de volgende dia.

Het MT DNA blijkt 16.600 bp te zijn en voor een aantal genen te coderen.

Als je op het COX-2 gen klikt krijg je de volgende informatie.

Het Y-chromosoom. Er zijn 307 genen gevonden op het Y-chromosoom.

Het X-chromosoom. Er zijn 1336 genen op het X-chromosoom gevonden, waarvan 20 nog niet gelokaliseerd.