BIO 42 Replicatie “hoe het DNA in een cel wordt verdubbeld”

Kan je DNA zien??? Het DNA dat in de kernen van een cel zit kan je zien m.b.v. een lichtmicroscoop. Het geïsoleerde DNA kan zichtbaar worden gemaakt m.b.v. agarose gelelectroforese.

Vergelijking DNA en RNA

De stikstofbasen A, C, G, T en U kunnen worden onderverdeeld in purines en pyrimidines In DNA komen A, C, G en T voor. In RNA: A, C, G en U.

RNA heeft een ribose als suikergroep De nucleotiden van RNA en DNA verschillen van elkaar in de suikergroep en in de stikstofbasen. 1 nucleotide RNA heeft een ribose als suikergroep DNA heeft een deoxyribose als suikergroep

In de cel komen meerdere vormen van nucleotiden voor: De nucleotiden die in DNA of RNA voorkomen bevatten 1 fosfaatgroep, de zg. dNMPs of NMPs Nucleotiden kunnen ook 2 of 3 fosfaatgroepen bevatten. Dat is aan de afkorting (en de naam ) af te lezen. AMP, ADP, ATP of (Mono, Di of Tri). Aan de afkorting van een nucleotide (dATP/ATP) is af te lezen of het om een nucleotide voor DNA (d) of voor RNA gaat.

Replicatie Wanneer wordt het DNA vermenigvuldigd??????? (Ook wel replicatie genoemd!!) Hoe wordt het DNA vermenigvuldigd? Waar wordt het DNA vermenigvuldigd

Wanneer wordt het DNA vermenigvuldigd??????? Tijdens de interfase wordt alles in de cel voorbereidt voor de volgende celdeling en wordt ook het DNA vermenigvuldigd! Dat laatste gebeurt specifiek in de S-fase!!! Celcyclus

De M-fase wordt onderverdeeld in de Profase, de Metafase, de Anafase en de Telofase. B t/m F

Hoe wordt het DNA vermenigvuldigd? Voor de replicatie is een enzym nodig (een eiwit) die het nieuwe DNA maakt. Dit enzym is een DNA polymerase dat voluit DNA afhankelijk DNA polymerase wordt genoemd.

Om de replicatie te kunnen uitvoeren moet de DNA helix (de α helix) worden ontwonden. Dat doet het enzym helicase. De twee DNA strengen worden in de enkelstrengs vorm gehouden door andere eiwitten (ss-binding proteins)

Synthese (verlenging van) van DNA Het DNA polymerase heeft nodig: matrijs een 3`OH -groep aan een stukje ds DNA en dNTPs. De energie die vrijkomt bij afsplitsing van twee fosfaatgroepen maakt de binding van de nucleotide aan het 3` OH mogelijk. De syntheserichting van DNA is (gezien vanuit de te synthetiseren streng) van 5`naar 3`.

DNA polymerase in actie Omdat het DNA Polymerase niet zomaar op een DNA streng (= de matrijs of template) kan beginnen moet er een beginnetje worden gemaakt. Dat gebeurt door het enzym (Primase). Deze maakt een begin = een primer. Dit is bij de replicatie altijd een stukje RNA. Het stukje RNA eindigt met een 3’-OH uiteinde, waar het DNA polymerase aan kan binden en het kan verlengen met een dNTP.

ds DNA is opgebouwd uit 2 antiparalelle polynucleotiden. de synthese richting is altijd van 5’→ 3’ is. 1 van de 2 DNA strengen kan van begin tot eind in een continue beweging worden gemaakt….de leading strand De andere streng wordt in stukjes gemaakt; de Okazaki fragmenten

Elk nieuw stukje DNA start dus met een RNA- primer. Nadat de DNA-synthese door DNA polymerase is begonnen, wordt het RNA verwijderd ( door RNase = endonuclease). De gaten (gaps) worden daarna met dNTPs opgevuld door (een ander) DNA polymerase). Bij eukaryoten zijn er nl. meerdere vormen DNA polymerases actief.

Het enzym ligase verbindt uiteindelijk alle korte fragmenten (=Okazaki fragmenten) met elkaar. Het enzym vormt de covalente band tussen de korte fragmenten (maakt de fosfodiëster binding weer compleet). 5’ 3’

Een overzicht van de verschillende enzymen die bij de DNA synthese betrokken zijn.

De plaats waar de DNA helix ontwonden wordt door het enzym topo-isomerase en enkelstrengs gemaakt wordt door helicase, wordt de replicatie vork genoemd.

Tijdens de replicatie wordt de RNA primer verwijderd Tijdens de replicatie wordt de RNA primer verwijderd. Er blijft daardoor aan de 5’-uiteinden van het DNA een gap over, een ss- stuk DNA. Dit stukje ss DNA kan in de meeste cellen nooit meer dubbelstrengs gemaakt worden!!!!!! Het gaat om de telomeren van de chromosomen.

De telomeren wat beter in beeld. Telomeren bevatten lange stukken met repetitief DNA telomeer

Per replicatie van het DNA wordt er een stukje telomeer niet verdubbeld!!! De lengte van de telomeren varieert per persoon. Bij de conceptie is de gemiddelde lengte 20.000 bp, bij de geboorte 11.000 bp. 20 jaar : 8000 bp, 50 jaar 7000. Het verlies is 50 – 100 bp per jaar.

In bepaalde cellen (kiembaancellen en .. is het enzym telomerase actief. Een enzym dat de telomeer-uiteinden kan verlengen.

DNA replicatie start altijd bij een ORI. Een ORI is de origin of replication, een specifieke nt volgorde. Daar begint de replicatie vork. Eukaryotisch DNA heeft meerdere ORI’s en dus ook meerdere replicatievorken Het DNA Polymerase herkent m.b.v. 6 andere eiwitten de ORI sequentie. Iedere ORI heeft 2 replicatievorken Bacterieel DNA heeft maar 1 ORI.

Fouten tijdens de replicatie Tijdens de replicatie worden door het DNA polymerase fouten gemaakt. Dit gebeurt 1 : 10.000 nt’s. Na de “proofreading” van het DNA- polymerase vinden we nog maar 1 : 109 foute nt’s. terug. DNA polymerase blijkt naast de synthese activiteit nog twee andere activiteiten te hebben: Exonuclease van 5’→ 3’ Exonuclease van 3’→ 5’ Op http://chem-faculty.ucsd.edu/kraut/cover.html zie je het DNA polymerase aan het werk.

PCR en sequencen Twee veel gebruikte technieken die erg lijken op de synthese van DNA zoals die tijdens de replicatie plaatsvindt. Deze technieken komen ook nog aan bod!!