DNA micro arrays Heel recente techniek Gene array, GeneChip (Affymetrix), genome chip Huidig probleem: grote hoeveelheden RNA-nodig 2-5 µg mRNA; 107-108 cellen; 1 tot 10 mg weefsel Gebaseerd op reverse hybridizatie Niet gelabelde probes op glas of membranen (nylon of nitrocellulose) in spots kleiner dan 200 µm 2 grote varianten (zie artikelen) Niet geschikt voor de novo gen ontdekking

DNA micro arrays cDNA-probes Probes 500 tot 5000 basen, aanmaken van cDNA libraries met PCR, OPZUIVERING Met spotting robot immobiliseren op drager Nadelen: lange probes kunnen aanleiding geven tot mismatch hybridisatie, arbeidsintensief Voordeel: kan zelf aangemaakt worden Zie artikel vb van gen expressie studie

DNA micro arrays GENEXPRESSIE studies Verschillen in gen expressie tussen cellen bestuderen (ziekte-gezond, met-zonder stimulus,...) RNA extractie, met oligo-dT primer cDNA synthese met fluorescente labels Cye3-dUTP of Cye5-dUTP Transcription bias oplossen door vergelijkende studie Na hybridizatie scannen met laser an CCD camera

DNA micro array met cDNA probe

DNA micro array met cDNA probe

DNA micro arrays Oligonucleotide arrays Probes 20-25 basen, kunnen rechtstreeks op chip (glas slide) gesynthetiseerd worden Fotolithografie en oligonucleotide synthese

Oligonucleotide arrays

Oligonucleotide arrays Probes 20-25 basen, kunnen rechtstreeks op chip (glas slide) gesynthetiseerd worden Fotolithografie en oligonucleotide synthese Nadeel: moet door firma aangemaakt worden (custom synthese) Affymetrix Voordeel: polyvalenter, specifieker door meerdere kortere probes per gen, mismatch controles Zie artikel

Oligonucleotide arrays Toepassingen: Gen-expressie vergelijkbaar met cDNA-probe micro arrays Meerdere probes per te bestuderen gen Perfect match – mismatch probes Kunnen voor een aantal toepassingen aangekocht worden (zie atikel) GEBRUIK: Gen-expressie voor klassificatie van kankers, ziekte progressie voorspellen, gevoeligheid voor bepaalde therapeutica voorspellen

Oligonucleotide array GENEXPRESSIE studies

Oligonucleotide array GENEXPRESSIE studies Typisch resultaat na verwerking door computer Geclusterde gen expressie Groen betekent minder dan referentie cellen Rood meer dan referentie cellen Zwart gelijke expressie

Oligonucleotide arrays Toepassingen: Gen-expressie DNA-sekwentie informatie Testen voor gekende mutaties in ziekte genen Single nucleotide polymorfimsen DNA sequentie bepalen van een bepaald gen KAN ENKEL MET OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS

Oligonucleotide arrays Bepalen van de DNA sekwentie van een bepaald gen, of sommige genen Detectie van mutaties, substituties

Oligonucleotide arrays Detectie van verschillende allelen van een bepaalde DNA-sequentie Polymorfismen van genen SNP analyse en mapping

Allel specifieke oligonucleotide hybridizatie ASO Dot-blotting, target DNA op membraan (nylon, nitrocellulose) aanbrengen en binden Denatureren en gelabelde probe hybridiseren, wassen en detectie (radio-actief of niet radioactieve technieken (zie vroeger)) Kan gebruikt worden voor detectie van puntmutaties ASO-probe 15-20 nucleotiden, verschil centraal in probe Ook reverse dot-blot met ASO, ongelabelde probe gebonden op membraan, hybridiseren met gelabeld target (analoog aan LiPA en AMPLICOR)

ASO

ASO

Oligonucleotide ligation assay OLA Test voor gekende punt mutaties of polymorfismen Gebaseerd op ligeren van twee probes indien complete complementariteit Gebruik DNA-ligasen: rTth, T4 DNA ligase Testen voor 31 gekende mutaties in één enkele analyse Flourescent gelabelde probes met laser fluorescentie detectie

Oligonucleotide ligation assay OLA

Fluorescente labels FAM HEX TET Pentaethylene oxide eenheden Fluorescente labels FAM HEX TET Voor elke label (aantal common probes) moet IEDERE selectieve probe een verschillende lengte hebben

Oligonucleotide ligation assay OLA

In situ amplificatie (In situ PCR) PCR in gefixeerde weefsels of cellen, correleren van PCR reultaat naar morfolgie Gevoeliger dan in situ hybridizatie ISH Cel voldoende permeabiliseren voor PCR reagentia, doch voldoende intact om PCR producten te behouden Studie van gen expressie en mutaties in abnormale cellen of weefsels

In situ amplificatie (In situ PCR) Proteinase K Formalin paraformaldehyde Denhardt’s solution

Southern blotting Ook ASO probe mogelijk Ook niet radio- Actieve labeling mogelijk

RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism Gebruikt southern blotting Typeren van mutaties die een restrictie-site veranderen en grote inserties of deleties tussen restrictie-sites Ook voor genotypische klassificatie van virussen

RFLP Detectie met DNA-probe specifiek voor b-globine gen GEEN ASO-probe

Restriction mapping Gebruikt ook Southern blotting Detecteerd gen-deleties, met intragene DNA-probe (probe tegen sekwentie in het gen) Kleine deleties (100 tal basen) korter fragment Grote deleties geen fragment indien homozygoot, heterozygoot minder intens ten opzichte van andere fragmenten Vb 21-hydroxylase deficiency (deficientie in cortisol en aldosteron productie)

Restriction mapping Pseudogenen Functionele genen 1 2 1 1

Northern blotting Variant van Southern waarbij het target RNA is ipv DNA Studie van expressie patroon van een gekloond gen in verschillende weefsels Geen restrictie enzymen nodig

Northern blotting