De zoektocht naar functionaliteit in het post-genoom tijdperk Proteomics: De zoektocht naar functionaliteit in het post-genoom tijdperk

1. Wat is proteomics? 2. Waarom proteomics? 3. Traditionele proteomics 4. Praktisch voorbeeld

Wat is proteomics ? De studie van de eigenschappen van proteïnen (graad van expressie, posttranslationele modificaties, interacties) op grote schaal om een globaal en geïntegreerd beeld te verkrijgen van netwerken van proteïnen, cellulaire processen en ziekteprocessen. Blackstock & Weir (1999), Trends Biotechn.3: 121-127

Relatie DNA-RNA-Proteïne GENOMICS (HUGO) Afbeelding cel : Stap 1-2-3 : Het DNAis aanwezig in de kern en wordt overgeschreven tot RNA en verwerkt tot boodschapper RNA. Dit boodschapper RNA verlaat de kern en wordt vertaald naar een steeds groeiende polypeptideketen. Wat gebeurt er hier juist? Het boodschapper RNA is geschreven in een bepaalde code. Deze code wordt per triplet vertaald naar 1 aminozuur. De az worden aan elkaar geplaatst en vormen deze steeds groter wordende polypeptideketen. Wanneer de volledige mRNA molecule vertaald is, is de polypeptideketen volledig gevormd en zal ze opvouwen tot een eiwit. Na dit proces gebeuren er nog heel wat modificaties met dit eiwit : posttranslationele modificaties bv. Er worden chemische groepen op het eiwit geplaatst, kleine stukjes worden afgeknipt, er worden complexen gevormd en dit allemaal om een functioneel actief eiwit te vormen. HUGO vs HUPO : grootschalig onderzoek op DNA niveau vs eiwitniveau Stap verder zetten : kijken naar relatie genoom - proteoom PROTEOMICS (HUPO)

Relatie genoom - proteoom Instructies Proteïnen Statisch Dynamisch Alle genetische informatie zit opgeslagen onder de vorm van DNA. Alle DNA sequenties vormen het genoom. Het genoom bestaat uit een set van instructies om proteïnen aan te maken. Alle proteïnen samen vormen dan het proteoom. Statisch vs dynamisch : Proteïnen zijn heel dynamisch. Ze voeren talrijke functies uit: - Ze voelen een invloed in hun omgeving en kunnen hierop reageren. Ze ontvangen niet enkel signalen, maar kunnen eveneens zelf signalen versturen. Ze breken ons voedsel af en zetten het om in energie Ze verdedigen ons tegen indringers Ze bouwen op, breken af Proteïnen zorgen er voor dat een normale cel omgevormd wordt tot een woekerende kankercel Ze spelen een grote rol in een ziektemechanisme Door deze dynamiek is het proteoom zeer complex : 1 genoom vs verschillende proteomen Complex

Proteomics is ... De studie van de eigenschappen van proteïnen: graad van expressie, posttranslationele modificaties, interacties op grote schaal om een globaal en geïntegreerd beeld te verkrijgen van netwerken van proteïnen, cellulaire processen en ziekteprocessen.

Waarom proteomics ? - Analyse van genomen blijkt niet voldoende om de biologische functie op te helderen - Er is geen lineaire relatie tussen een gen en z’n proteïne complement in een cel - Expressie van een eiwit verandert tijdens groei, ziekte en dood van cellen, een weefsel of een organisme Geen lineaire relatie: Een gen is nodig om een eiwit te vormen, het bevat de instructies om dit eiwit te vormen. Maar uit 1 gen kunnen meerdere eiwitten ontstaan, bv door verschillende posttranslationele modificaties van het eiwit. Dus 1 in de cel komt niet overeen met aanmaak van slechts 1 eiwit, vandaar geen lineaire relatie - Proteïnen spelen een belangrijke rol in pathogenese van een ziekte => onderzoek op eiwitniveau

Daarom proteomics ! - Proteomics zal bijdragen tot het beter begrijpen van de functie van een gen - Proteomics zal een belangrijke rol spelen in de zoektocht naar geneesmiddelen Proteomics is de link tussen genen, proteïnen en ziekte. Eiwitten spelen een belangrijke rol in ziektemechanismen en geneesmiddelen zijn gericht tegen de functies van deze eiwitten. Dus onderzoek op eiwitniveau kan leiden tot een beter inzicht van de functie die bepaalde eiwitten uitvoeren tijdens een ziektemechanisme en dus naar de zoektocht van nieuwe geneesmiddelen die de specifieke functie van eiwitten in een bep. Ziekte gaat inhiberen.

Traditionele proteomics 1. Twee-dimensionele gelelektroforese 2. Beeldanalyse 3. Massaspectrometrie 4. Bioinformatica Proteomicsanalyse: gezonde cel vs kankercel

1. Twee-dimensionele gelelektroforese Principe : scheiden van proteïnen volgens lading en moleculair gewicht + - 3 4 5 pH gradiënt 6 7 MW Onderzoek op eiwitniveau -> dus eerst eiwitten extraheren uit de cel en scheiden. 1e dimensie : scheiden langs een pH gradiënt onder invloed van een potentiaalverschil.

pH gradiënt MW Werkelijk beeld van een twee-dimensioneel gel. Extract van hersenen van muis. Elke spot stelt 1 eiwit voor en men kan zo’n duizend eiwitten visualiseren op deze manier. We hebben een beeld van onze eiwitpopulatie van beide condities. Hoe gaan we deze vergelijken. De beelden worden gedigitaliseerd en geanalyseerd met behulp van een softwareprogramma.

2. Beeldanalyse Controle Experiment Informatie : 1. Positie van de spot (x,y) 2. Intensiteit van de spot (i) Analyse van de beelden : kwalitatief - kwantitatief We halen twee parameters uit de analyse van een twee-dimensioneel gel : Enerzijds 1. Positie bepaald door x en y-coördinaat. Waar x overeenkomt met de lading van het eiwit en y met z’n moleculair gewicht. Anderzijds 2. Intensiteit bepaald door i. De intensiteit is representatief voor de hoeveelheid eiwit er aanwezig is. Als men beelden wilt vergelijken. Men wil gaan kijken welke verschillen er zijn tussen het beeld van de gezonde cel en de kankercel, dat kan men op twee manieren doen : Kwalitatief : We kijken welke spots er aanwezig zijn op de beelden van de ene groep en bv afwezig in de andere groep Kwantitatief : Men kijkt naar het verschil in intensiteit van de spot, dus een varierende i coordinaat. Bv we wensen alle eiwitten te kennen die minimuum een factor 1.5 gestegen zijn in intensiteit of en minimuum een factor 1.5 gedaald zijn. Deze variaties tonen verschillen aan in de aanmaak van eiwitten. De eiwitten die differentieel geëxpresseerd worden in de experimentele groep zouden potentieel belangrijke eiwitten kunnen zijn in de pathogenese van bv kanker. Uit de analyse van de twee-dimensionele beelden die de eiwitpopulatie voorstellen van bv de gezonde cel enerzijds en de kankercel anderzijds halen we een populatie eiwitten die een differentieel expressiepatroon vertonen. Deze eiwitten kunnen interessant zijn en we wensen die te identificeren. Dit gebeurt door massaspectrometrie.

Op weg naar de massaspectrometer Uitknippen van de spot Digest van het eiwit Extractie van peptiden Ontzouten van het staal

3. Massaspectrometrie a) Het vormen van ionen MALDI = Matrix assisted laser desorption ionization Electrospray ionization Massaspectrometrie is een methode waarbij de massa van ionen geanalyseerd worden. Er zijn twee methoden om eiwitten en peptiden te ioniseren : MALDI : het staal wordt in een chemische matrix geïncorporeerd en beschoten met een laser waardoor ionen ontstaan. Electrosprau ionization : het staal wordt in een naald gebracht waarop een potentiaal verschil geplaatst wordt. Hierdoor onstaat er een mist van druppeltjes die op hun weg naar de massaspectrometer hun watermantel zullen verliezen. De ionen waarover ik spreek zijn geladen peptiden, geladen stukjes van het eiwit dat we wensen te identificeren. Welke informatie kan men nu halen uit de analyse van die ionen die eigenlijk de peptiden voorstellen van onze eiwitten uit ons gel.

b) Analyse van ionen in TOF massaspectrometer Massa’ s van peptiden Ionen meten volgens m/z Sequentie-informatie De ionen dat gevormd worden geanalyseerd in een Time-Of-Flight massaspectrometer volgens hun M/z. Hoe gebeurt dit juist? -> Een TOF massaspectrometer bestaat uit een veldvrije buis. De ionen komen deze buis binnen en moeten een bepaalde afstand afleggen vooraleer ze op de detector vallen. De tijd dat de ionen afleggen om deze detector te bereiken wordt geregistreerd. Kleine ionen, die een kleinere massa hebben zullen deze weg sneller afleggen dan ionen met een grote massa. Op die manier wordt er onderscheid gemaakt tussen kleine en grotere ionen of peptiden en kan men dus alle ionen scheiden. Uit deze analyse kunnen we dus de massa van de peptiden bepalen. Maar door gebruik van een tweede massaspectrometer kunnen we eveneens de aminzoorsequentie waaruit dit peptide bestaat bepalen. Sequentie-informatie : Het is mogelijk om de aminozuursequentie van het peptide te achterhalen met massaspectrometrie. Het betreffend peptide wordt geselecteerd in de eerste massaspectrometer en gefragmenteerd in een botsingscel oiv gasmoleculen. De fragmenten worden geanalyseerd in de tweede massaspectrometer. Hoe deze fragmentatie juist gebeurt ziet u op deze foto, en dit is een complex proces. Als u daar meer informatie overwenst kan ik die altijd kunt mij altijd persoonelijk komen vragen tijdens de posterpresentatie. Een werkelijk fragmentatiespectrum ziet er zo uit. U ziet dat het mogelijk is om sequentieinformatie uit een peptide te halen met massaspectrometrie.

Geen proteomics zonder genomics 4. Bioinformatica - Data afkomstig van massaspectrometer : 1. Massa van peptiden 2. Sequentie-informatie - Data versturen naar databanken om proteïne te identificeren. We krijgen twee soorten data uit de analyse van peptiden door massaspectrometrie. Geen proteomics zonder genomics

Praktisch voorbeeld Proteomics analyse van transgene muizen In samenwerking met K.U.L. en Janssen Research Foundation. Transgene muis Controle muis = muis dat genetisch gemanipuleerd is en een vreemd gen bevat in z’n genoom. In dit geval een gen dat codeert voor een eiwit mogelijks betrokken bij de ziekte van Alzheimer Doel : invloed van transgenese in de hersenen van de muis - onderzoek naar beter inzicht in pathogenese van de Ziekte van Alzheimer (poster)

2DE pH gradiënt 3 10 MW (kDa) 200 116.25 97.4 66.2 45 31 21.5 14.4 6.5 Wij voeren traditionele proteomics uit en gaan ons extract scheiden met 2DE. Van elke groep maken we 6 gels, drie afkomstig van vrouwelijke muizen en drie afkomstig van mannelijke muizen. Uit deze drie beelden maken we een algemeen composiet beeld. Hetzelfde gebreurt voor de beelden afkomstig van de mannelijke muizen. Uit twee composietbeelden wordt eveneens een composiet beeld gemaakt. Dit beeld is representatief voor de volledige controle groep en bovendien zijn kleine verschillen inzake intensiteit en spotpositie in rekening gebracht. Idem voor de transgene groep. Deze composietbeelden worden vergeleken. Het maken van deze beelden is belangrijk om de resultaten statistisch te kunnen verantwoorden en doordat wij eveneens een composiet van elk geslacht geïncorporeerd hebben, zijn onze resultaten eveneens sexe-onafhankelijk. Wij kozen voor een kwantitatieve analyse waarin we eiwitten wilden bekijken die minimum een factor 1.5 gestegen of gedaald waren in eiwitexpressie. In totaal waren er 34 eiwitten die een differentieel karakter vertoonden, waarvan 8 gedaald -in rood en 26 gestegen - in zwart Bv. Spot 503 is een eiwit dat minimuum een factor 1.5 gedaald is in expressie. Welk eiwit stelt deze spot voor?

Sequentie naar databank MS/MS spot 503 Sequentie naar databank Identificatie van deze spot gebeurde op basis van sequentieinformatie. Uit het fragmentspectrum afkomstig van de massaspectrometer bekomen we de aminozuursequentie dat u hier ziet. Deze wordt naar de databank gestuurd en het peptide is afkomstig van 14-3-3 zeta/delta protein. De databank kan dus geen onderscheid maken tussen de zeta en de delta vorm van het eiwit. Na verdere analyse van peptiden afkomstig van hetzelfde eiwit konden we besluiten dat het om 14-3-3 zeta protein gaat. Spot 503 = 14-3-3 zeta/delta protein

Tabel I : Lijst van geïdentificeerde eiwitten met een verschillend expressieniveau in htau transgene muizen Op deze slide ziet u de tabel met de 34 geïdentificeerde eiwitten die een minimuum een factor 1.5 veranderd zijn in expressie in de transgene muis. Een zeer belangrijk deel van een proteomicsstudie is de interpretatie van de resultaten. Hoe zijn deze eiwitten gelinkt aan de transgenese en aan de ziekte van Alzheimer. Spot 503 : 14-3-3 zeta protein is een signaal transductieeiwit dat in hoge mate aangemaakt wordt in de neuronen. Dit eiwit speelt een rol in de de ziekte van Creutzfeld-Jakob, een andere neurodegeneratieve ziekte, en zou dus eveneens een rol kunnen spelen in de ziekte van Alzheimer Link met pathogenese?

Proteomics ... - is het genoom aan het werk en dit is een dynamisch proces - karakteriseert en catalogeert proteïnen - bestudeert interacties tussen eiwitten en identificeert hun functie - zal bijdragen tot het beter begrijpen van genfunctie - vergelijkt variaties in graad van expressie van proteïnen tussen gezond en ziek - zal een belangrijke rol spelen in de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen

Sequencing the human genome is a fantastic feat, but we have a long way to go before we can understand how all those A’s, T’s, C’s and G’s add up to a Tiger Woods or a Britney Spears, says Stanley Fields in the journal Science.