Horizontale DNA-overdracht Introductie van DNA Transformatie: vrij DNA: hoe doorheen de celwand/ celmembraan ? Transductie: met viruspartikel: in vitro verpakking noodzakelijk (infectie => transfectie) Conjugatie: cel-cel contact: DNA moet in een cel aanwezig zijn (nb. manipulaties beperkt tot recombinatie of andere in vivo mechanismen) ! Uiteraard “initiële” transformatie vereist ! Eventueel met donor E. coli – via conjugatieve transfer van pendelvector (“shuttle vector”) naar andere gastheer.

Horizontale DNA-overdracht Illustratie conjugatie

ColE1 : mobiliseerbaar door F F zorgt voor de pili ColE1 heeft nic/bom locus (oriT) en codeert Mob-eiwitten pBR322 : geen mob gebied (eiwitten); wel nic/bom plaats mobiliseerbaar in triparentaal mechanisme F of Ia-type plasmide : pili ColK plasmide : voor de mob-functies (nb. belang van (kennis van) compatibiliteit) pBR327 : heeft geen nic/bom (oriT) meer (idem voor pAT153) niet mobiliseerbaar, tenzij door co-integraatvorming (soms conductie genoemd) transfer m.b.v. mobiliseerbaar plasmide (co-integraat): - recA-afhankelijk : homologe recombinatie met een mobiliseerbaar replicon - recA-onafhankelijk : co-integratie bij transpositie

pSUP plasmiden : (Bielefeld, 1984-1990) verhoging van efficientie van DNA-overdracht door gebruik van oriT van incP (RP4, RK2) of incQ (RSF1010) plasmiden (zie verder voor informatie over deze plasmiden) - klonering van een Sau3AI oriT-bevattend fragment van RP4 in een aantal standaardvectoren pACYC177 => pSUP301 pACYC184 => pSUP101 pBR325 => pSUP201, 202 en 203 - op pSUP202 werd een transposon geplaatst (Tn5) indien suicide plasmide kan hiermee het transposon overgedragen worden naar een bacteriestam waarin het parentale plasmide niet kan repliceren - in pSUP5011 werd het oriT fragment in de transposonsequentie geplaatst. Dit maakt het mogelijk dat na een eerste transfer, waarbij het transposon (met oriT) op een genetisch element overgedragen is, dit element te mobiliseren en naar een andere stam verder te brengen (of terug te brengen naar de oorspronkelijke stam).

nb. het gebruik van de term mob is hier onnauwkeurig (misleidend) en staat door de cis-functie oriT

Integratieve klonering : Vector niet-repliceerbaar (zelfmoordplasmide) Circulair DNA : enkelvoudige homologe recombinatie Gelineariseerd DNA : dubbele homologe recombinatie (uitwisseling) Enkelvoudige recombinatie genereert een herhaling (dus ook instabiliteit) In vitro excisie met restrictie-enzym dat niet in oorspronkelijke construct knipt In vivo uitsplitsing identificeerbaar indien het replicon actief is (vgl. met alleluitwisseling in hoofdstuk over S. cerevisiae) Restrictie-enzyme splitst : - in homoloog gebied : excisie van oorspronkelijk plasmide - buiten het homoloog gebied : herhaling blijft behouden bij excisie => recA- stam vereist voor stabiliteit - in polylinker gebied : herhaling is weg : extensie aan slechts één zijde

Recombinatie tussen homologe sequenties (enkelvoudige cross-over)

Recombinatie tussen homologe sequenties (dubbele cross-over) Integratie via dubbele cross-over in bvb. B. subtilis genoom (Ook methode voor het genereren van deletiemutanten via uitwisseling van actief gen, door gen onderbroken door een resistentiemerker (zie verder) )

Genomic integration of an unmarked mutation using sacB : The fragment, cloned in a narrow host range vector, is mutagenized in E. coli by inserting the nptI-sacB-sacR cassette (symbolized by a black and white dot). The recombinant plasmid is introduced into the Gram negative recipient and double recombination events are isolated by selection for neomycin resistance (expressed from the nptI gene) and verified by loss of the vector encoded resistance marker (marked by the black box). The insertion mutant, generated by this gene replacement is sucrose-sensitive (Sucs) due to the presence of the sacB gene. In a second step, most of the nptI-sacB-sacR cartridge is removed from the cloned fragment, resulting in an unmarked point mutation (or frame-shift). The recombinant molecule is introduced from E. coli into the insertion mutant, where a second double recombination event can be selected on plates containing sucrose. Only cells which have lost the nptI-sacB-sacR cartridge by marker exchange are able to grow on high sucrose concentrations (Sucr, Neos).

Klonering in andere bacteriën (niet E. coli) Waarom? E. coli Voordelen : veel vectoren beschikbaar eenvoudig transformeerbaar geschikt voor heel wat toepassingen : o.a. DNA-sequentieanalyse, gerichte mutagenese, recombinante eiwitexpressie, enz. Beperkingen: mist bepaalde ‘pathways’ (bvb. reactiewegen) noodzakelijk voor fenotypische analyse van bepaalde functies van andere bacteriën : specifieke gastheren nodig – sommige genfuncties vereisen de “eigen” gastheer post-translationele modificaties van eiwitten complementatiefuncties, enz.. Andere gastheer Vereisten: DNA moet geïntroduceerd kunnen worden (bvb. door transformatie, conjugatie, enz.) DNA moet stabiel behouden blijven in de cel (moet functioneren als replicon of in chromosoom ingebouwd worden) Expressie vanaf plasmide (expressiesignalen: transcriptie/translatie)

Klonering in andere bacteriën (niet E. coli) Bijkomende vragen: welke resistenties als merkers te gebruiken ? Gevoeligheid van gastheer voor antibiotica ? vectoren: eigen plasmiden ? fagen ? andere ? restrictiefenomenen (op vreemd DNA) ? recombinatie ?

Introductie van DNA; horizontale DNA-overdracht Transformatie “Natuurlijke” mechanismen meestal transiënt fenomeen sequentie-afhankelijk of sequentieonafhankelijk het natuurlijk mechanisme omvat nuclease splitsing van dsDNA, degradatie van van 1 streng en opname van lineair ssDNA

Conjugatie : - IncPa plasmiden RP4, ~60 kb - IncP plasmiden: transfer van zichzelf en compatibele vectoren - IncP plasmiden kunnen IncQ plasmiden, bvb. RSF1010 mobiliseren - ook transfer mogelijk van E. coli naar Gr+ - relatief groot aantal zelfoverdraagbare plasmiden bij Gr+ Bvb. plasmide pAMb1, origineel Enterococcus faecalis, ook conjugeerbaar naar E. coli. nb. pAMb1 repliceert volgens een “theta-mechanisme” (zoals ook ColE1) en is stabieler dan heel wat andere plasmiden die volgens een “rolling circle mechanisme” repliceren (hetgeen makkelijker deleties veroorzaakt).

Vectoren afgeleid van IncQ-groep plasmide RSF1010 multicopy replicon niet-zelf conjugatief; mobiliseerbaar resistentie t.o.v. sulfonamide en streptomycine unieke restrictieherkennings- sequenties (RHS) niet bruikbaar omwille van verlies van resistentie – interferentie met expressie vereiste nieuwe RHS en selectie- merkers heel wat derivaten, inclusief pSUP vectoren RSF1010

Mini-versies van de IncP-groep plasmiden IncPa plasmide Vb. RP4 en RK2 ~60 kb, conjugatief en mobiliseerbaar grote plasmiden Afgeleide mini-IncP plasmiden ~ 5-7 kb, nog steeds breed spectrum gemeenschappelijke polylinker – lacZ’ regio – blauw/wit selectie oriT = origin of transfer replicatie – mobiliseerbaar parDE, parCBA operons: grotere stabiliteit in segregatie trfA : houdt het aantal kopijen laag ; excisie ervan (met NdeI-SfiI) verhoogt het aantal kopijen

Mini-versies van de IncP-groep plasmiden

Vectoren afgeleid van breed-gastheerspectrum plasmide pSa, Agrobacterium tumefaciens IncW plasmide: pSa grijs : functies nodig voor replicatie paars (donker) : nodig voor zelf-transmissie (tussen SstII en SalI : suppressie van tumorinductie door A. tumefaciens)

Vectoren afgeleid van breed-gastheerspectrum plasmide pSa, Agrobacterium tumefaciens IncW plasmide: pSa - zelfoverdraagbaar naar grote groep Gr- - vector voor “oncogene” A. tumefaciens - 2 regio’s voor conjugatie; 4 kb-regio voor replicatie in diverse gastheren afgeleide vectoren met unieke RHS en insertie-inactivatie van één resistentiemerker door klonering; ook afgeleiden met faag l cos-site : functioneert als cosmidevector. derivaten : niet conjugatief maar mobiliseerbaar door andere conjugatieve plasmiden.

Klonering in andere bacteriën (niet E. coli) Primrose & Twyman hoofdstuk 10 Klonering in gram-positieven Geen universele vectoren t.g.v. zeer sterke verschillen in GC-gehalte: Range: <30% tot >70%  onderscheid hoog/laag GC-gehalte organismen Hoog GC-gehalte, e.g. Streptomyces spp. Laag GC-gehalte, e.g. Bacillus spp., Clostridium, Staphylococcus, Lactococcus … Vaak elektroporatie (soms inefficiënt) Bacillus subtilis – specifieke methoden – Box 10.1

Klonering in andere gram-negatieven (niet E. coli) In de regel : pendelvector of breed-gastheerspectrum plasmide Indien klein natuurlijk plasmide beschikbaar  optie pendelvector / fusie met bestaande E. coli vectoren – voordeel indien beschikbare resistentiemerkers ook in de nieuwe gastheer werken breed-gastheerspectrum plasmide: - grootte - meerdere selectiemerkers (soms) - unieke restrictieherkenningsposities – bij voorkeur positieve selectie

Behoud van het DNA: stabiel als plasmide (zie hoger – indien replicatie) verloren gaan (geschikt voor transposon “delivery”) integreren in ander replicon, meestal chromosoom (enkele cross-over) recombinatie tussen homologe sequenties (dubbele cross-over) Integreren in ander replicon, meestal chromosoom (enkele cross-over) Optie: selectie voor integratie in geval geen stabiel replicon pBR322 integratieve vector met neomycine resistentiemerker en gedeelte amyE (a-amylase gen van B. subtilis) - selectie op integratie; 1 kopij per cel - toepassing: naburige sequenties kloneren. Fig 10.2

Laag GC-gehalte Gr+  Efficiënte transcriptie/translatie Transcriptie / verschillend van E. coli RNA polymerase gelijkaardig; evenwel verschillende sigma-factoren Naast -35 en -10 geconserveerde posities, ook veelal -16 geconserveerd TGTG- motief  weinig voorkomend bij E. coli Bij mutaties in deze regio, sterk verlies van de promoteractiviteit Translatie / verschillend van E. coli B. subtilis ribosomen herkennen enkel eigen mRNA (niet E. coli mRNA) In tegenstelling tot E. coli ! Reden ? Missen het S1 ribosomaal eiwit – staat normaal in voor aspecifieke binding aan RNA en translocatie naar 30S subeenheid (SD alignering en start translatie vanaf startcodon) – sterker geconserveerde SD-sequentie

Klonering in gram-positieven Laag GC-gehalte Gr+ Veelal plasmiden van S. aureus gebruikt – ook functioneel in andere Gr+ pC194, pUB110 – eigen B. subtilis plasmide (pTA1060) Problemen bij directe klonering in B. subtilis (zie box-info)  pendelvectoren E. coli – B. subtilis  manipulaties in E. coli – plasmide-extractie, multimere plasmiden te transformeren naar B. subtilis Tabel 10.2 (p.192) Problemen bij herschikking van grotere inserties- invloed van type replicatie van plasmide – ‘thèta’ versus ‘rolling-circle’ ColE1-gebaseerde vectoren via thèta-replicatie pAMbeta1 = enige ‘thèta’-type replicatie Hogere stabiliteit / pendelvectoren / mobiliseerbare

Laag GC-gehalte Gr+  Gecontroleerde expressie in gastheren met een laag GC-gehalte Spac systeem in B. subtilis E. coli lacI gen promoter van faag SPO1 – gekoppeld aan de lac operator => induceerbaar met IPTG E. coli T7 systeem in B. subtilis T7 RNA polymerase-gen geïnsereerd in het chromosoom achter een xylose-induceerbare promoter Doelwitgen onder controle van T7 promoter op B. subtilis vector Xylose-induceerbare promoter (B. subtilis, Staphylococci, Lactobacillus)

Laag GC-gehalte Gr+  Gecontroleerde expressie in gastheren met een laag GC-gehalte nisA, nis F systemen in Lactococcus lactis nisA, nisF promoter induceerbaar met nisine – expressieniveau afhankelijk van nisineconcentratie Andere: Tabel 10.3  Secretie van vreemde eiwitten Exportmechanismen gelijkaardig aan E. coli Verschillen in signaalsequentie – meer positief geladen N-terminus + langer Probevectoren voor selectie van secretiesignaalsequenties zijn gebaseerd op gesecreteerde reporteractiviteit (S. aureus nuclease) Selectie van secretiesignalen – monitoring van nuclease- activiteit in het medium Prom MCS Nucleasegen

Laag GC-gehalte Gr+  Geninactivatievectoren : studie van genen uit gekende genoomsequenties studie van genfuncties rechtstreekse insertionele mutagenese in het chromosoom pMUTIN vector

Laag GC-gehalte Gr+ pMUTIN vectoren  Kenmerken insertionele mutagenese – geen onafhankelijk replicon in B. subtilis lacZ reporter voor expressiemonitoring induceerbare Pspac promoter voor induceerbare expressie  Procedure PCR/doelwitgen – insertie in pMUTIN transformatie naar B. subtilis bij integratie: * onderbreking van doelwitgen – eigen promoter wordt gefusioneerd aan lacZ reporter (geninactivatie – ‘null mutation’) * stroomafwaartse genen onder controle van Pspac (conditionele mutatie) lacZ reporter voor expressiemonitoring induceerbare Pspac promoter voor induceerbare expressie (IPTG)

Laag GC-gehalte Gr+ pMUTIN vectoren

pSPORTn3 pBR322 en derivaten bevatten nog een inverted repeat element van Tn3 Door het her-invoeren van een tweede element, kan een transponeerbaar element gecreëerd worden. Het transposase (gecodeerd door het tnpA gen) wordt voorzien vanop een additionele (compatibele) vector (bvb. pSC101).

Klonering in andere bacteriën (niet E. coli) Hoog GC-gehalte Gr+ O.a. Streptomyces spp.  Algemeen heel wat spp. maken antibiotica aan – studie synthesewegen G+C content: ~70-75%, A/T –rijke RHS weinig voorkomend promotors liggen vaak behoorlijk ver voor de translatiestartplaats complexe promotersequenties – sommige > 100 bp voor startcodon (tandemplaatsen voor verschillende sigma-factoren)  DNA-opname Transformatie van protoplasten in aanwezigheid van PEG 106 – 107 transformanten/µg supercoiled DNA Elektroporatie na beperkte lysozyme-behandeling (geen protoplastvorming) Intergenerische conjugatie van mobiliseerbare plasmiden van E. coli naar Streptomyces (tra genen in trans voorzien; oriT (nic/bom) plaats aanwezig Antibioticumselectiemerkers vaak moeilijk wegens inherente resistentie van de cel

Hoog GC-gehalte Gr+  Vectoren RSF1010 repliceert ook in Streptomyces – andere niet afgeleid van Streptomyces endogene plasmiden of fagen plasmide: veelal afgeleid van SCP2*  aanleiding tot stabiele, laag-kopij aantal (theta-replicatie) vectoren vectoren met hoog aantal kopijen (300) afgeleid van het "kleine" plasmide pIJ101 bijzondere loci voor integratie in chromosoom (o.a. pSAM) f faag: getemperde faag fC31 ; ook integratieve varianten BACs waarin 100 kb DNA inbouwbaar is ; pendelvectoren naar E. coli ook integratieve strategieën (in Streptomyces)

T

- geïsoleerd in 1955 uit een bodemstaal in New-Mexico (Streptomyces azureus) - structuur opgelost in 1970 - slecht oplosbaar in water ; onstabiel in zuur en alkali actief tegen grampositieven ; door slechte oplosbaarheid geen doorbraak niet in humane geneeskunde - mogelijks wel ook anti-malaria en antikanker eigenschappen - (topicaal) veterinair antibioticum (bij mastitis) - 10 ringen, 11 peptidebindingen, sterk onverzadigd, 17 chirale centra (toch succesvolle chemische totaalsynthese gerealiseerd) bindt het GTPase domein in 23S-rRNA ; inhibeert translatie - toepassing in gentechnologie van Streptomyceten (rRNA methylase als resistentiegen)