Klonering van grote DNA segmenten : BAC, PAC, YAC vectoren. cfr. o.a. Primrose & Twyman : hfdst. 5 Cosmiden : inserts 30-45 kbp : selectie door inpakrestrictie in faag l partikels (zie een vorig hoofdstuk 6) Zoektocht naar fagen met grotere inpakmogelijkheden (o.a. getest op faag T4, maar lukte er niet echt mee) wel succesvol met faag P1 (d.i. een E. coli getemperde faag, vooral extensief gebruikt voor algemene transductie) Gebruik van F-plasmide als replicon, met de komst van elektroporatie als DNA-transformatie- techniek leidde dit in 1992 tot BAC vectoren. ('bacterial artificial chromosome'). Combinatie van P1 en BAC eigenschappen leidde in 1994 tot PAC vectoren. ('P1-derived artificial chromosome'). Met BAC en PAC vectoren kunnen DNA segmenten tot 300 kb gekloneerd worden, hoewel (wegens geen grootte-selectie) vaker inserts van 100-150 kb (of zelfs minder) bekomen worden. DNA isolatie, en intactheid, spelen uiteraard een belangrijke rol. Het concept (en terminologie) "artificial chromosome" was reeds in 1987 ontwikkeld in S. cerevisiae met de YAC vectoren (bij de studie van DNA-stabiliteit in gist bij toevoeging van telomeer-sequenties aan een YCp vector DNA ).

E. coli bacteriofaag P1 een getemperde faag van E. coli. medieert algemene transductie. het genoom is circulair gepermuteerd en terminaal redundant (10 kb). het unieke (niet-gerepeteerde) DNA is ongeveer 90 kb. bij lysogenie integreert het faag DNA niet in het chromosoom maar blijft als extrachromosomaal DNA in laag aantal kopijen in de cel ("als plasmide"). bij inductie tot lytische ontwikkeling fungeert een lytisch replicon dat tot hoog aantal kopijen amplificeert. in het faaggenoom volgt na pac een loxP plaats : bij replicatie ontstaat concatenatie en volgen opeenvolgende loxP's elkaar op per ~90 kb. Pacase splitst per ~110 kb, zodat (alleen) het eerste product 2 loxP sequenties heeft. 2 loxP-sequenties (op hetzelfde molecule) worden herkend door het product van het cre gen (Cre recombinase)  circularisatie van (sommige) DNA moleculen in E. coli in 1990 ontwikkeld tot een vectorsysteem waarin ~100 kb insereerbaar is totale capaciteit inpakbaar DNA: ~110 kb (in tegenstelling tot wat bij faag l gebeurt, is dit hier wel via een “headfull” mechanisme) pac (‘packaging site’) sequentie : startplaats voor verpakking essentieel element, splitsing door Pacase kan ook in vitro gebruikt worden

Het concatemeer DNA wordt gesplitst op opeenvolgende 110 kb posities (vanaf de pac). De loxP plaatsen liggen ongeveer 90 kb uit elkaar (het unieke DNA in het P1 genoom). Er worden ongeveer 4 faagkoppen gevuld per concatemeer DNA, maar slechts één heeft twee loxP’s, en kan dus cycliseren in een recA E. coli mutant. (Cre is faaggekodeerd.)

Vector-DNA wordt bereid als twee armen, één met pac + loxP, de andere met de replicatiefuncties, resistentiemerker en loxP. In een trimoleculaire ligatiereactie wordt insert-DNA ingebouwd. Transductie naar een E. coli die het Cre-recombinase tot expressie brengt, zodat het verpakte DNA kan circulariseren Klonen met laag-kopijaantal – selectiemerker/kanamycine resistentie. Eventueel hoger kopijenaantal via het P1 lytisch replicon Inserts tussen 70 en 100 kb Voorbeelden: P1 vector Ad10 (1990), pAD10sacBII (1992) Het inpakmechanisme gebeurt via een "headful" mechanisme, zodat voldoende "extra" DNA in de lange arm als "stuffer" aanwezig moet zijn. Oorspronkelijk daarvoor adenovirus DNA gebruikt, hetgeen de nomenclatuur van de eerste (en ook latere) vectoren verklaart. In latere vectoren werd vooral het sacB ingevoerd voor positieve selectie van recombinanten, evenals faag RNA-promotoren rond de insertieplaats om makkelijk RNA sondes te kunnen maken.

Faag P1 vectorsysteem loxP sequentie : (locus of crossing-over (X) in P1) 5' TTTCGTTCTTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT 13 bp omgekeerde herhalingen, die een 8 bp “spacer” flankeren. De spacer bepaalt de directionaliteit (orientatie) van recombinatie : zelfde orientatie : uitsplitsing met (door Cre) circularisatie van het geëxciseerde DNA tegengestelde orientatie : omkering van de tussen de loxP’s liggende sequentie kan zowel intra- als intermoleculair (fusies) Cre : type I topoisomerase van faag P1 vereist geen energie-cofactoren in faag P1; kan ook in trans voorzien worden actief op loxP plaatsen : meestal als het Cre-lox systeem omschreven

Faag P1 vector pAd10SacBII

Faag P1 vector pAd10SacBII Kenmerken 2 loxP sequenties pac sequentie: verpakking in P1 faagpartikels kanr : kanamycineresistentiegen P1 plasmide-replicon : circulair DNA aan ~1 kopij/cel P1 lytisch replicon (‘lytisch replicon’) : onder controle van de lac promoter (induceerbaar met IPTG) : plasmide-amplificatie vóór DNA-isolatie sacB: positieve selectiemerker voor klonen met insert-DNA (BamHI-site) met faag SP6 en T7 promoter

BAC vectoren : bacterieel artificieel chromosoom (1992) vectoren ontwikkeld op basis van het E. coli F plasmide : 1 of 2 kopijen per cel replicatie (unidirectioneel) : vereist oriS en repE : RepE : helicase (bevordert DNA replicatie) parA, parB en parC voor correcte partitie over de dochtercellen (stabiel behoud van het plasmide) insertie van DNA door in vitro ligatie (later ook mogelijk gemaakt via in vivo recombinatie) transformatie door electroporatie ; geen verpakkingsextracten vereist (evenmin mogelijk) er is dus geen selectie op insertgrootte bij voorkeur gebruik van een recA- E. coli waardcel structureel-stabiel behoud van mens- en plant-DNA (> 100 generaties) antibioticumresistentiemerker nodig voor selectie nieuwere BAC-vectoren : met lacZa of sacB gen voor herkenning of positieve selectie van recombinanten unieke splitsbaarheid van grote DNA's vergemakkelijkt door het voorzien van cosN, loxP, SceI, NotI, SfiI, ... (cosN is de 22bp sequentie in het cos gebied met het l-terminase als endonuclease, dat splitst met vorming van de 12 bp uitstekende uiteinden) veelal T7 en SP6 promotoren voor aanmaak van RNA sondes zeer efficient voor genoomkartering en isolatie van operons, enz. Manipuleerbaarheid van het gekloond DNA is moeilijker gezien de grootte (unieke knipplaatsen?)

Voorbeeld : pBeloBACII

PAC vectoren : faag P1-afgeleid artificieel chromosoom (1994) Combinatie van elementen uit de BAC en faag P1 vectorsystemen replicatie zoals P1-vectoren, maar ontdaan van verpakkingssignalen sacB, positieve selectiemerker P1 plasmide en lytisch replicon geen verpakking in P1 faagpartikels geen cre-loxP systeem voor circularisatie – circularisatie bij in vitro ligatie introductie door elektroporatie Voorbeeld: pCYPAC1 insertgroottes bij klonering in BACs of PACs zijn vergelijkbaar ; eventuele geobserveerde verschillen hebben allicht eerder met DNA bereiding te maken dan met inherente karakteristieken. Inserties tot 300 kb werden bekomen ; De DNA-banken hebben meestal een gemiddelde grootte tussen 80 en 120 kb.

Voorbeeld : pCYPAC1

YAC-vectoren : ‘yeast’ artificieel chromosoom (gist) (1982-1987) Vroege YACs : Szostak & medewerkers bestudeerden telomeer DNA van eukayoten in 1982 toonden ze voor het eerst aan dat in gist een extra DNA molecule lineair behouden kon blijven mits toevoeging van telomeer sequenties in een YRp vector. Dit was een aanzet tot verdere ontwikkeling, o.a. op een YCp basis (m.a.w. met een centromeer en reductie tot 1 kopij per haploïde cel). Dit leidde tot een “echt” artificieel chromosoom. Minimum vereiste voor stabiliteit : 40-50 kbp lengte, maar inserties tot honderden kb bleken later mogelijk. pas in 1987 werd een kloneringsprocedure met YAC vectoren uitgewerkt verdere ontwikkeling tot circulaire YAC’s, en TAR klonering

"Klassieke" YACs : lineair DNA : architectuur zoals een gist chromosoom (met ARS, CENtromeer en TELomeren) recombinante YAC’s door ligatie van grote DNA fragmenten aan twee “armen” introductie in gist door transformatie op iedere arm : een selecteerbare merker en een telomeer sequentie - één arm bevat een centromeer, ARS (replicatie in gist), en ori (voor E. coli) - er is tevens een selectiemerker voor E. coli - om aanmaak van vector DNA in E. coli mogelijk te maken is er een verbindings-DNA tussen de telomeren, uitsplitsbaar met BamHI de twee vectorarmen worden dus aangemaakt door splitsing met EcoRI + BamHI selectie van gisttransformanten op selectieve agar (TRP, URA3 in de voorbeelden) recombinanten kunnen herkend worden door een wit => rood omkleuring : gebaseerd op een suppressor tRNA gen (SUP4) dat een 'ochre' nonsense mutatie (UAA) in het ade2 gen onderdrukt (waardoor witte kleur). minimum-grootte nodig voor normale “segregatie” van YAC’s (>20 kbp)

yeast artificial chromosome (YAC) Lineaire YAC (met telomeersequenties) versus (zie verder) (“Circulaire” YAC) = “gecirculariseerde” YAC (“in feite een BAC”) – eliminering van de telomeersequenties (door recombinogene klonering)

Klonering in YAC vectoren : Het genoom van de YAC vector omvat twee selectiemerkers (TRP en URA), een autonoom replicerende sequentie (ARS), een centromeer (CEN4), een suppressor tRNA gen, en telomeer sequenties (TEL) aan de uiteinden. De vector is circulair bij replicatie in E. coli, door koppeling van de TEL uiteinden met een extra BamHI fragment dat exciseerbaar is (zie vorige slide). NB. ade2 is een mutant allel van fosforibosylamino-imidazole carboxylase. De mutatie is een nonsense mutatie (ochre) die door Sup4 gesuppresseerd kan worden. Transformanten met de parentale vector (actief Sup4) groeien tot witte kolonies op een medium van zuur-gehydrolyseerd caseïne. Bij recombinanten (Sup4 geïnactiveerd) is het enzym niet aanwezig en accumuleert fosforibosylglycinamide in de cellen tot rood-roze kolonies : biedt dus een bijkomende identificatiemerker (op een ade2 mutante giststam).

Voorzorgen : bij bewerkingen : mogelijk probleem bij manipulaties van grote DNAs : intact houden ! => kleine fragmenten verwijderen door PFGE fractionatie voor klonering => polyamines toevoegen (inhibeert DNA afbraak) => de inserts van de eerste YAC-DNA banken waren niet groter dan 100 kb Toch zijn er uiteindelijk (na optimalisatie) YAC-banken gemaakt van het menselijk genoom met inserts van gemiddeld 810 kb, zelfs sommige tot 1800 kb (en zelfs groter). => mogelijkheid om grote intacte genen te isoleren (die bij hogere eukaryoten meer dan 1Mb kunnen zijn) Mogelijke problemen met klassieke (lineaire) YAC’s : 20-60% zijn chimere YAC’s : verschillende genomische regio’s gekloneerd in één YAC (co-ligatie vóór transformatie of recombinatie in gist) (lijkt vooral bij de protoplast-stap bij transformatie op te treden) => beter intacte cellen gebruiken instabiliteit : verlies van YACs en deletie van interne regio’s in de YACs (gedurende transformatie en groei/deling)  oplossing : recombinatiedeficiënte giststammen gebruiken ; echter daardoor  trage groei + inefficiënte transformatie (behalve met het rad54-3 allel) Lage opbrengst + moeilijk te scheiden van gastheer genomisch DNA (15 Mb)  PFGE

Oplossing voor deze problemen : Circulaire YACs : makkelijk en snel naar E. coli overbrengbaar makkelijk isoleerbaar via alkalische DNA bereiding (circulair cccDNA denatureert/renatureert efficienter) circulaire YACs die ook te manipuleren zijn in E. coli als BACs een "gespecialiseerde BAC" waarop - een gist centromeersequentie (CEN6 in de figuur) (= het centromeer van chromosoom VI) - een G418R selectiemerker, en HIS - alle nodige BAC elementen voor behoud in E. coli - twee homologe sequenties die respectievelijk aan deze en gene zijde van de kloneerplaats in de klassieke YAC-vector liggen (dit worden de plaatsen waar door recombinatie het insert wordt overgeplaatst) ("hooks" genoemd : de hooks zijn gescheiden door een unieke SalI knipplaats) linearisatie van deze “BAC” met SalI, gevolgd door recombinatie in gist en het ontstaan van een circulaire YAC (repliceerbaar in gist door CEN6 + ARS) voordelen : nu gemakkelijk te scheiden van de lineaire chromosomen : - alkalische hydrolyse, minder shearing-gevoelig. - grotere structurele stabiliteit (100-200 kb inserts vergelijkbare stabiliteit met BAC-kloons) - grotere inserten : tot 40% chimeren, maar niettemin structureel stabiel => bestudeerbaar - elektroporeerbaar naar E. coli (tot 250-300 kb)

Klonering tot een circulaire YAC Transformatie naar een giststam waarin een (lineaire) YAC aanwezig is : homologe recombinatie tussen het binnenkomende DNA (met homologe sequenties aan de uiteinden) en deze residente YAC. Recombinatie tussen YAC met genomische insert en de “BAC” met functionele gistelementen CEN6 sequentie (= centromeer), selectiemerkers, maar geen ARS in de “BAC”  dus de “BAC” repliceert niet in gist) Door de recombinatie wordt de “BAC” opgeladen met één of meer ARS sequenties waardoor hij kan repliceren in gist (stabilisatie met CEN6, selecties met HIS en KAN (G418R)

TAR : transformation-associated recombination Similair zoals hierboven, maar nu als doelwit een sequentie die tussen de promotor van ADH1 (S. pombe alcohol dehydrogenase) gen ligt en het URA3 gen (zonder eigen promotor). Deze promotor laat tot 130 bp toe tussen de TATA box en de transcriptie-initiatieplaats. Hier kunnen dus twee 'hooks' van 60 bp liggen. TAR-gemediëerde isolering van genomische segmenten door recombinatie Expressiemodule met URA3 : promotor PADH1 van S. pombe - max. 130 bp - URA3 (orf) (tot 130 bp is getolereerd tussen de TATA box en de transcriptiestart) Een insert kan "uitgevist" worden uit het genoom, en selectie gebeurt met 5-FOA : positieve selectie van recombinanten : zonder insert wordt door Ura3p het toxic product ingebouwd ; de overlevenden zijn recombinanten. Co-transformatie van lineaire vector (geknipt tussen de hooks) en (ander) genomisch DNA is mogelijk zodat de techniek uitbreidbaar is tot genomen uit hogere organismen. Transformatie van sferoplasten (meer recombinogeen dan intacte cellen).

5-FOAR 5-FOAS

Overzicht : kloneren van grote fragmenten * Overzicht : kloneren van grote fragmenten Kloneren van grote fragmenten : cosmiden, P1, PAC, BAC, YAC - overzicht Vector Capaciteit (kb) Replicon Gastheer Kopijenaantal Introductie Cosmide 30-45 ColE1 E. coli hoog transductie P1 70-100 P1 E. coli 1 (amplificeerbaar) transductie PAC 100-300 P1 E. coli 1 elektroporatie BAC 120-300 F E. coli 1 elektroporatie YAC 250-2000 ARS gist 1 transformatie P1, cosmiden : insertiegrootte beperkt door verpakkingsmogelijkheid in faagpartikels BAC, PAC’s : minder chimerisatie, eenvoudige bankconstructie, eenvoudige DNA-manipulaties – klonering/insertie YAC’s : probleempunten : chimerisatie ; stabiliteit Belang : - kartering en analyse van complexe genomen ; isolatie operons - beter zicht op overlappende klonen – naburige sequenties in grote genomen - opstellen van fysische kaarten - inzoemen op bepaalde genomische regio’s/operons (sequentieanalyse & hybridisatie)