De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Characterization of VMF and vaginal probiotics

Verwante presentaties


Presentatie over: "Characterization of VMF and vaginal probiotics"— Transcript van de presentatie:

1 Characterization of VMF and vaginal probiotics

2

3 Geautomatiseerde (fluorescente) electroforese Capillaire electroforese (ABI310) Capillair Detectievenster: LASER: excitatie fluorescentie + camera: detectie fluorescentie Gedenatureerde PCR-producten, blauw gemerkt door inbouw van blauw fluorescent gemerkte primer en gemengd met interne merker met rode fluorescentie Vloeibaar gel dat na elke run in capillair wordt gepompt

4 Berekening van de fragmentlengtes van de PCR-fingerprint (blauw) ahv fragmentlengtes van een merker (rood)

5 Voordelen van capillaire electroforese Hoge resolutie: 1 nucleotide-verschil kan gedocumenteerd worden Betere normalisatie en hogere reproduceerbaarheid door interne merker Onmiddellijke digitalisatie van de DNA-fingerprint: in silico vergelijking van de fingerprint met honderden andere fingerprints Hoge throughput: 16 runs per 45 min volgende run wordt automatisch gestart

6 PCR-gebaseerde genotypische identificatie van gekweekte organismen Gisten, schimmels: Gisten, schimmels: ITS2-PCR + Capillaire electroforese Bacteriën: Kweek + Isolatie + DNA-extractie + 16S rDNA-PCR + Restrictie-analyse + Agarose GE: ARDRA 16S rDNA-PCR + Sequentiebepaling tDNA-PCR + Capillaire electroforese

7 ITS2-PCR: Fungi Genotypische identificatie van gekweekte organismen

8 ITS2-fragment lengths obtained for different Candida species. In total 13 runs are presented, corresponding to 8 different species. C. guilliermondi C. glabrata C. parapsilosis C. tropicalis C. albicans C. dublinienis C. lipolytica C. lusitaniae

9 Genotypische identificatie van gekweekte organismen 2. Amplified rDNA restriction analysis (ARDRA)/Mycobacterium

10 See Website Differentiation between closely related Clostridium spp. by means of ARDRA

11 Bp HhaI (CfoI) digestion of mycobacterial amplified rDNA M 1 1’ 1” M Bp

12 Identification by means of obtained ARDRA profiles HhaIMboIRsaISpecies 111M. tuberculosis 122M. intracellulare 1’41M. kansasii / M. malmoense 1’42M. scrofulaceum 1’43M. xenopi 1” 43M. botniense 222M. avium 335M. abscessus 574M. simiae 544M. chelonae 544’M. interjectum 71M. fortuitum 842M. gordonae 911M. marinum 1334M. chelonae

13

14 tDNA-spacer length-PCR Genotypische identificatie van gekweekte organismen

15 tRNA-PCR fingerprint of strain LIS29: Listeria ivanovii subsp. ivanovii TET-labelled, ABI Prism 310 Capillary Electrophoresis

16 tRNA-PCR fingerprints van 2 L. ivanovii ivanovii stammen

17 tRNA-PCR fingerprints van 4 L. ivanovii ivanovii stammen

18 tRNA-PCR fingerprints van 4 L. ivanovii ivanovii stammen (blauw) + 1 L. ivanovii londoniensis stam(zwart)

19 tRNA-PCR fingerprints van 4 L. ivanovii ivanovii stammen (blauw) + 4 L. ivanovii londoniensis stam(zwart)

20 1. Clonering van 16S rDNA + Sequeneren van de clones 2. t-RFLP: 16S rDNA-restrictie + Capillaire electroforese 3. Real-Time PCR 4. FISH: in situ hybridisatie (Alexander Swidsinski, Berlin, G) 5. DNA-array (Rutger Persson, Berne, CH) Aan deze snelle en discriminatieve PCR-gebaseerde technieken voor identificatie en typering van gekweekte gisten en bacteriën Typering: RAPD Identificatie gisten: ITS2-PCR Identificatie bacteriën: ARDRA, tDNA-PCR, 16S rDNA-sequentiebepaling werden ook DNA-technieken voor kweekvrije karakterisatie van de complexe microflora in klinische monsters toegevoegd:

21 infection of URT in CF-patients: Pseudomonas aeruginosa Frans De Baets, Pediatric Pulmonology - mucocenter GUH chronic otitis media: Haemophilus influenzae, Alloiococcus otitidis? Ingeborg D'Hooge, Otorhinolaryngologie, GUH burn wounds: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Jean-Paul Pirnay, Patrick Soentjens, BWC, Nederoverheembeek [foreign object infections: catheters, valves,...: Staphylococcus spp.] [acne: Propionibacterium acnes] [recurrent UTI: uropathogenic Escherichia coli] bacterial vaginosis: Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae Biofilm en chronische, recurrente infectie: Public announcement of US National Institute of Health: "Biofilms are medically important, accounting for over 80% of microbial infections in the body" (Davies Nature Reviews 2: ) Research thema LBR: chronische infectie Microbiologie

22 VMF & APO Vaginal microflora & Adverse Pregnancy Outcome

23 FEMPRO: formulation, delivery and assessment of efficacy of vaginal probiotics Vrouwenkliniek Marleen Temmerman Hans Verstraelen Kristien Roelens Vanden Broeck Davy Marijke Trog Inge Tency Paul Defoort (PND) Ellen Roets (PND) Anne Van Mullem (PND) Delphine Berbiers (PND/vervanging) Martine Meulebroek (zelfst vrvr cons, PND/vervanging) Roozie De Paepe (zelfst vrvr cons) Maaike Vandenbroucke (zelfst vrvr cons) Heleen Roothooft (zelfst vrvr cons) Ellen Van Holle (zelfst vrvr cons) Marleen De Block (studievpk) Marleen Remmery (hoofdvpk) LBR Microbiologische karakterisatie Selectie probiotische stammen Mario Vaneechoutte Rita Verhelst Ellen De Backer Nabil El Aila Bart Saerens Guido Lopes do Santos Santiago Thierry De Baere Leentje Van Simaey Catharine De Ganck Pieter Deschaght LFT Formulatie probiotische stammen Jean Paul Remon Nathalie Huygebaert Nele Poelvoorde Chris Vervaet GOA & FemPro Vakgroep Microbiologie Kweek, Gram-kleuring, antibiogram, BV expertise Geert Claeys Gerda Verschraegen Klinische studies Luc Van Bortel Decorte Steven Annick Broeckaert Tom Van Paepegem Fabienne De Boeck Bart Dereyne Katrien Broeckaert Metabolomics Jan Van Bocxlaer Ruben 't Kint Ellen De Backer Hogeschool West Optimalisatie kweek lactobacillen Katleen Raes

24

25 40-50% Risico-factoren voor vroegtijdige geboorte

26 Protective role of normal vaginal microflora Oestrogen Glycogen Lactic acid H2O2H2O2 Bacteriocines Lactobacillus Mucus Epitheli al cells Afweer- cellen 1892: Döderlein: Lactic acid is primary molecule responsible for low vaginal pH 1897: Glycogen is direct precursor of lactic acid in the vagina

27 Normale vaginale microflora (VMF) Bacteriële vaginose Normale VMF: veel - uitsluitend - lactobacillen Bacteriële vaginose: * lactobacillen verdwenen (!) * complexe microflora in de plaats Gardnerella vaginalis (!) anaërobe Gram-negatieven * 'clue cells' (!) = karakteristieke cellen

28 Bacterial vaginosis Number of germs Normal Symptoms Lactobacillus: H 2 O 2 - producing Gardnerella vaginalis Anaerobes pH pH Overgang normale VMF naar Bacteriële vaginose (BV)

29 Bacteriële vaginose Definitie: Verstoring van de normale vaginale microflora, bestaande uit melkzuurproducerende lactobacillen. Lactobacillen worden vervangen door complex mengsel van Gram-variabele anaëroben Epidemiologie: 5 – 36% van de zwangere vrouwen 60% van de Afrikaanse vrouwen Kliniek: Genitale jeuk, branderigheid Slechtruikend vaginaal verlies Bij 50% asymptomatisch Diagnostiek: Niet gevoelig Niet specifiek Therapie: Faalt bij 50% van de vrouwen: BV is een chronische infectie Belang: Oorzaak voor helft van vroeggeboortes Verhoogt HIV-transmissie!

30 Sequelae of BV Infectious problems of the female urogenital tract, shown to be related to disturbance of normal vaginal microflora * BV: Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, anaerobes, (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum) * STD: Chlamydia trachomatis: da Silva CS GOInvest. 58: 189 Mycoplasma genitalium Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum: syphilis HPV: cervix carcinoma (BV co-factor?): da Silva CS GOInvest. 58: 189 Herpes Simplex Virus 2: Cherpes TL et al CID 40: 1422 Trichomonas vaginalis HIV!!! * Yeast vaginitis: Candida albicans: Rodrigues AG et al * Group B streptococci: Streptococcus agalactiae neonatal meningitis * UTI: Escherichia coli: Gupta et al. 1998, Atassi et al Gram negatives: Chan et al. 1984, Fraga et al. 2005, Osset et al Staphylococcus aureus

31 Sequelae of BV BV & HIV BV: 1. increases susceptibility for HIV-infection 2. increases HIV shedding: Cu-Uvin CID 33: 894 Sewankambo Lancet 350: > increases sexual HIV-transmission --> increases perinatal mother-child HIV-transmission!? Taha & Gray Genital tract infections and perinatal transmission of HIV. Ann N Y Acad Sci. 918: 84-98

32 Sequelae of BV BV & UWI: vrouwen zijn vatbaarder dan mannen Gupta et al Inverse association of H 2 O 2 -producing lactobacilli and vaginal E. coli colonization in women with recurrent urinary tract infections. J Infect Dis 178: * 300 miljoen - 1 miljard gevallen per jaar (Reid Am J Clin Nutr 73: S437-S443) * One of the most common reasons for women to visit the family physician. * Each episode: on average 6 days of symptoms, often very painful * Uropathogens: E. coli (approx. 70%), Enterobacteriacae Enterococcus faecalis, Staphylococcus spp. * Increasing drug resistance among uropathogens * Sequelae: kidney infection (pyelonephritis) --> preterm birth preterm birth Hersenen

33 Sequelae of BV: APO PTB: Oorzaak van 75% van de neonatale sterfte 90% van de zeer vroeggeboren kinderen heeft levenslange sequellen Kostprijs: miljoen € per kind geboren tussen 26 en 37 weken. In België wordt 7-8% van de kinderen te vroeg geboren tot 8000 vroeggeboren kinderen = extra kost van 3-7 miljard € per jaar.

34 Bacteriële vaginose en vroeggeboorte: Door opstijgende infectie? Amnion Vagina Cervix

35 Foetale membranen (chorio-amnion - Terme bevalling Prostaglandine E2 synthese Humaan fosfolipase Fosfolipase D Preterme arbeid Vroeggeboorte Normale fysiologie Bacteriën (opstijgende infectie) Pathofysiologie Veresterd arachidonzuur in membraan sphingolipiden Vrij arachidonzuur Foetaal membraan cyclo-oxygenase Bacteriële vaginose en vroeggeboorte: Door gelijkenis tussen bacteriële enzymes en arbeidscascade-reacties?

36 Verstoorde vaginale microflora (BV): Samenvatting Bij 5-35% van vrouwen, > 50% in Zwart Afrika Bij helft van de vrouwen: vervelende symptomen Verhoogt kans op urogenitale infecties: UWI en SOA Verhoogt kans op infectie met en transmissie van HIV Verantwoordelijk voor helft van de vroeggeboortes, ook onrechtstreeks via UWI Verhoogt kans op peri- en postnatale verwikkelingen voor de moeder Bij tot 80% van de vrouwen: recurrent, chronisch

37 Sequencing Vaginal Swab Amniotic fluid tDNA-PCR Identification Microorganisms Grade Culture Microscopy AnalysisSample Gram stain Cloning Microbiologische technieken 16S rDNA amplification Real time PCR t-RFLP-analysis FISH DNA-arrays

38 Figure 3 Ia I-likeIIIII Ib Iab Categorisatie van vaginale microflora op basis van Gram-kleuring (en interpretatie op basis van moleculaire technieken)

39 Identification génotypique: Bifidobacterium spp. Normal vaginal microflora? Microscopy: atypical lactobacilli? Grade I-like

40

41 L. crispatus L. jensenii L. gasseri L. iners Verhelst R, Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Delanghe J, Van Simaey L, De Ganck C, Temmerman M, Vaneechoutte M Verhelst R, Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Delanghe J, Van Simaey L, De Ganck C, Temmerman M, Vaneechoutte M Cloning of 16S rRNA genes amplified from normal and disturbed vaginal microflora suggests a strong association between Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis and bacterial vaginosis. BMC Microbiol 4:16. Normale VMF: welke soorten? Kweek + tDNA-PCR identificatie van vaginale lactobacillen Baele, M., M. Vaneechoutte, R. Verhelst, M. Vancanneyt, L. A. Devriese, and F. Haesebrouck Identification of Lactobacillus species using tDNA-PCR. J. Microbiol. Methods 50:

42 Verhelst, R., H. Verstraelen, G. Claeys, G. Verschraegen, L. Van Simaey, C. De Ganck, E. De Backer, M. Temmerman, and M. Vaneechoutte Comparison between Gram stain and culture for the characterization of vaginal microflora: Definition of a distinct grade that resembles grade I microflora and revised categorization of grade I microflora. BMC Microbiol. 2005, 5: 61. Normale en verstoorde VMF: welke soorten? Kweek + tDNA-PCR identificatie van vaginale lactobacillen: Percentage lactobacillen per soort voor normale en verstoorde VMF

43 Clonering van bacteriële 16S rRNA genen geamplificeerd uit de vaginale microflora: principe Complex microbieel DNA-mengsel 16S rDNA-PCR met universele primers Clonerings- vector (plasmide) E. coli cellen N kolonies die allen een cloneringsvector met een verschillend 16S rRNA gen-insert bevatten ARDRA van plasmides

44 ARDRA voor een selectie van de clones die zullen gesequenced worden: van elk ARDRA-type één L. iners A. vaginae Sequenering P. bivia Besluit: clonering is ook een semi-kwantitatieve methode

45 Nombre de clones Age Species (N = 38) Normale en verstoorde VMF: welke soorten? Clonering en sequenering van geamplificeerd 16S rDNA Associatie met BV van Atopobium vaginae & Lactobacillus iners

46

47 Real-time PCR using quenched fluorescein probes

48 Real-Time PCR: more initial DNA gives earlier detection

49 Realtime PCR voor 6 bacteriesoorten. Resultaten per groep vrouwen: verschillende vaginale microflora

50

51 Paradox: BV staat ook gekend als Lactobacillus deficiency... op basis van kweek en Gram-kleuring. maar met clonering en realtime PCR vinden we voor BV massaal veel Lactobacillus iners ? L. gasseri L. iners groeit niet op MRS Besluit: op basis van Gram-kleuring en kweek ontsnapte L. iners aan onze aandacht.

52 Complex microbial DNA mixture from the vaginal swab 16S rDNA-PCR with universal primers (5’ labeled) Restriction with the enzyme BstUI Capillary electrophoresis with internal size standard. The number of peaks reflects the number of different species Identification is based on comparison with a library Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis: T-RFLP: Principle

53 A: grade Ia B: grade Iab E: grade III F: grade IV D: grade II C: grade Ib L. crispatus L. jensenii L. gasseri/ L. iners L. gasseri/ L. iners L. gasseri/ L. iners L. gasseri/ L. iners (L. crispatus) G. vaginalis/ Bifidobacterium spp. G. vaginalis/ Bifidobacterium spp. A. vaginae Prevotella spp. Dialister sp. (L. jensenii) L. jensenii S. agalactiae (S. agalactiae) (A. vaginae)

54 Rectaal/Vaginaal Studie: RVS 150 women, rectal and vaginal sampling Culture on different media + tDNA-PCR identification: ongoing Specific culture for group B streptococci GBS: 22% Culture on enrichment broth + Granada medium is optimal for GBS detection Realtime PCR for GBS: under development Genotyping of different Lactobacillus isolates per woman all vaginal Lactobacillus isolates: mostly only one or two species also one genotype per species vaginal and rectal isolates of same species: mostly same genotype! Welke zijn de soorten van de verstoorde vaginale microflora, bacteriële vaginose? Wat is de oorsprong van deze kiemen? Partner? Vaginaal? Faecaal?

55 Arbitratrily primed PCR (AP-PCR) Randomly Amplified Polymorphic DNA analysis (RAPD)

56 Arbitratrily primed PCR (AP-PCR) Randomly Amplified Polymorphic DNA analysis (RAPD)

57 M A A B C D C E F F G M B B B A A B B D D H M M F C C I I B’ G B’ RAPD-analyse met ERIC2 van Pseudomonas aeruginosa stammen van cystic fibrose patiënten

58 RAPD-analyse van Acinetobacter baumannii stammen M M

59 RAPD-analyse met fluorescente primer gevolgd door capillaire electroforese

60 Welke zijn de soorten en genotypes van de verstoorde vaginale microflora, bacteriële vaginose? Wat is de oorsprong van deze kiemen? Genotypering: fluorescente RAPD met primer OPM1

61 rvs Welke zijn de soorten en genotypes van de verstoorde vaginale microflora, bacteriële vaginose? Wat is de oorsprong van deze kiemen? Genotypering: fluorescente RAPD met primer OPM1

62 Recurrence rates of up to 80% within 3 months after treatment have been reported: Hay P Recurrent bacterial vaginosis. Curr Infect Dis Rep 2: Larsson PG & U. Forsum Bacterial vaginosis, a disturbed bacterial flora and treatment enigma. APMIS 113: This recurrence might be due to the survival of metronidazole or clindamycin resistant bacteria in the vagina, although Beigi et al. (2004) showed that < 1% of vaginal anaerobes is metronidazole resistant. Beigi RH et al Antimicrobial resistance associated with the treatment of bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol 191: Waarom is BV recurrent of chronisch? Resistentie aan gebruikte antibiotica?

63 Waarom is BV recurrent? Omdat Atopobium vaginae metronidazole resistent is? Metronidazole resistant? Geissdörfer et al J Clin Microbiol 41: Ferris et al Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis 4:5: ensemble: 4 souches testés: MIC metronidazole: > 32 µg/ml Possible reason for BV recurrence problem? Gram-positive elliptical cocci Strictly anaerobic Very fastidious Recently described (Falsen, 1999) One case report (PID, 2003) Metronidazole resistant (?) (2003, 2004) De Backer, E., R. Verhelst, H. Verstraelen, G. Claeys, G. Verschraegen, M. Temmerman, and M. Vaneechoutte Antibiotic susceptibility of Atopobium vaginae. BMC Infectious Diseases 2006, 6:51.

64 Atopobium vaginae Gardnerella vaginalis (n=9) (n=4) Antimicrobial agent Range (mg/L) Ampicillin< < Azithromycin< < Bacitracin Cefuroxim < Ciprofloxacin Clindamycin< 0.016< Colistin> 1024 Doxycycline Kanamycin Linezolid Metronidazole Nalidixic acid> 256 Penicillin Rifampicin< 0.002> 256 Vancomycin Waarom is BV recurrent? AB-gevoeligheid van A. vaginae en G. vaginalis 500 mg metronidazole intravaginal = maximal vaginal concentration of 2-10 mg/L Alper et al Obstetr Gynecol 65: Mattila et al AAC 23:

65 Swidsinski A, Mendling W, Loening-Baucke V, Ladhoff A, Swidsinski S, Hale LP, Lochs H Swidsinski A, Mendling W, Loening-Baucke V, Ladhoff A, Swidsinski S, Hale LP, Lochs H Adherent biofilms in bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecol. 106: % of the G. vaginalis biofilms were associated with Atopobium, which could reach up to 40% of the biofilm mass (i.e. 4 x bacteria per mm 2 ) Waarom is BV recurrent? Door G. vaginalis – A. vaginae biofilm? FISH: Fluorescent in situ Hybridization Lumen Vaginaal epitheel Biofilm Clue cells Swidsinski, A., W. Mendling, V. Loening-Baucke, S. Swidsinski, Y. Dörffel, J. Scholze, H. Lochs, and H. Verstraelen An adherent Gardnerella vaginalis biofilm persists on the vaginal epithelium after standard therapy with oral metronidazole. Am. J. Obstet. Gynecol Nov 14.

66 Gekend: de normale vaginale soort is L. acidophilus Gekend (recent): L. acidophilus is eigenlijk een groep van 7 soorten, met o.a. L. crispatus, L. gasseri, L. iners paradoxaal: het aantal lactobacillen daalt niet echt bij BV Onze bevindingen: 1. Gezonde vaginale microflora: L. crispatus: H positief 2. Verstoorde vaginale microflora: L. gasseri en L. iners: H negatief Verschillende nieuwe bevindingen door gebruik van moleculaire technieken Gekend: Gardnerella vaginalis is belangrijkste soort bij BV Gekend: clue-cellen zijn karakteristiek voor BV Gekend en paradoxaal: G. vaginalis verdwijnt bij AB-therapie toch is BV recurrent bij 80% van de vrouwen Onze bevindingen: 4. Moeilijk kweekbare Atopobium vaginae komt evenzeer voor bij BV en is zelfs meer specifieke merker voor BV 5. (ism A. Swidsinski, Berlijn: FISH): G. vaginalis en A. vaginae vormen biofilm. Dit verklaart * chronische infectie, want AB kunnen biofilm reduceren maar niet eradiceren = recurrente BV! * de typische clue-cellen: vaginale epitheelcellen met lagen bacteriën.

67 GRADE Ia, Ib, Iab L. crispatus (L. jensenii) (L. gasseri) GRADE W8 Peptostreptococcus Peptoniphilus GRADE I-like Bifidobacterium spp. GRADE III G. vaginalis A. vaginae L. iners GRADE II L. gasseri GRADE IV Streptococcus agalactiae (GBS) YV Candida vaginitis

68 Belang van DNA-technieken voor karakterisatie van de vaginale microflora Vaginale microflora Kweek directe amplificatie Identificatie van ‘onkweekbare’ soorten (bvb. L. iners en A. vaginae) Grotere analysecapaciteit Groter discriminerend vermogen, grotere analysecapaciteit (bvb. L. crispatus, L. gasseri, L. iners) DNA- gebaseerd biochemisch L. acidophilus, G. vaginalis en anaëroben Vaginal Swab Amniotic fluid FISH BioFilm

69 V.6. Betere behandeling? Rationale voor de ontwikkeling van vaginale probiotica Disturbed vaginal microflora is important: medically and commercially: Urogenital tract infections are a major problem, directly (patient) and with consequences (PTB, HIV, STD,...) There is a clear hypothesis about the role of lactobacilli (<> intestine?): The protective role of vaginal lactobacilli is clearly established. Several mechanisms of protective activity have been proposed and can serve as selection criteria for probiotic strains. Lactobacilli are predominant in the vagina (<> intestine) Application can be topical (<> intestine) --> reaching high inocula Clinical trials are easy to perform (<> intestine): Sampling is easy during clinical trials. Re-isolation of probiotic lactobacilli after application is easy. Several products are already available.

70 V.6. Les probiotiques vis à vis les antibiotiques: quelques remarques Probiotics vs antibiotics? Antibiotics (clindamycine more than metronidazole) damage commensal microflora Antibiotics can increase the occurrence of resistant bacteria Antibiotics can have adverse side effects (especially in pregnant women) Probiotics can be used in adjunction to antibiotics to restore the commensal microflora Antibiotics may be needed as initial therapy to increase the chance that probiotics can colonize the vagina

71 Toedienen van de probiotische stammen aan vrouwen met normale VMF 1. Welke stammen?: 4 geselecteerde: L. gasseri, L. crispatus 125, L. crispatus 128, L. jensenii. Welke?3 toedienen: beide L. crispatus stammen en L. jensenii Rationale: * Beide L. crispatus: om te vermijden een uitstekende stam te laten vallen vooraleer we de waarde kunnen evalueren hebben * L. jensenii: owv arginine dihydrolase * L. gasseri niet: vnl. bij graad II en moeilijke productie (kleverig) 2. Welk inoculum?: 1 miljoen kiemen per soort per toediening. Rationale: Bewaringsproeven tonen aan dat na 9 maand dit inoculum nog aanwezig is Het effect van de probiotische stammen moet dus met max 1 mio kiemen kunnen gehaald worden, anders is het product niet meer effectief na 9 maand 3. Welke formulering? Lyofilisatie (klassiek) of layering op pellets?: Pellets Rationale: Bewaring (shelf life) van pellets lijkt beter (WP2) Spreading, retentie van pellets intravaginaal lijkt beter (WP2) 4. Welke capsule: HPMC of gelatine? Spreading gelatine beter? (WP2 pilootstudie 4) Shelf life van pellets in gelatine capsule tov pellets in HPMC capsule?

72 Invloed van formulatie op initieel haalbaar inoculum en op bewaarbaarheid bij 4 °C Pellets (layering) vs lyofilisatie (vriesdrogen) L. crispatus 128: 1 test, periode: 9 maand

73 Invloed van formulatie op initieel haalbaar inoculum en op bewaarbaarheid bij 4 °C Pellets (layering) vs lyofilisatie (vriesdrogen) L. crispatus 125: 1 test, periode: 9 maand

74 L. jensenii improvement of shelf life 1% vit C

75 PELLETSPOEDERPELLETSPOEDER Vergelijking spreiding en retentie van gelatine capsules met pellets resp. poeder Na 6 h Na 24 h

76 V.6. Clinical trials with vaginal probiotics Eschbach, W., Kludas, M Über die Fortdauer einer Besiedlung der menschlichen Scheide mit lebenden, lyophilisierten Döderleinbakterien auf Wattetampons. Ärtzliche Wochenschrift 12: Eschbach, W., Kludas, M On the maintenance and restoration of ideal vaginal states in sexually mature women by Doederlein bacteria. Med. Klin. 55: Mohler, R., and C. Brown Döderlein's bacillus in the treatment of vaginitis. Am J Obstet Gynecol 25: Start klinische trial met probiotisch mengsel in optimale formulatie: voorjaar 2008


Download ppt "Characterization of VMF and vaginal probiotics"

Verwante presentaties


Ads door Google