De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Expressie van het DNA Transcriptie (bij pro- en eukaryoten) Splicing, gewoon en alternatief RNA-editing MicroRNAs.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Expressie van het DNA Transcriptie (bij pro- en eukaryoten) Splicing, gewoon en alternatief RNA-editing MicroRNAs."— Transcript van de presentatie:

1 Expressie van het DNA Transcriptie (bij pro- en eukaryoten) Splicing, gewoon en alternatief RNA-editing MicroRNAs

2 Expressie van het DNA: Transcriptie, processing en translatie

3 Transcriptie De transcriptie start bij een speciale DNA-sequentie: de Promotor Deze sequentie ligt in de coderende DNA streng. De andere DNA streng (de template streng) wordt als template voor de RNA synthese gebruikt. De synthese wordt uitgevoerd door DNA afhankelijk RNA Polymerase. De Transcriptie wordt gereguleerd. Verschil pro- en eukaryoot. De coderende streng

4 Transcriptie Coderende streng Het enzym heeft geen 3’ - 5’ exo nuclease activiteit. 1 : : 10 5 nt is fout. Is dat erg???

5 E.coli promotors worden herkend door het RNA – polymerase holoenzym (5 subunits) waaraan een 6 e subunit, de σ factor is gebonden. E. Coli promotoren σ σ 70 bindt aan alle “housekeeping” genen. Enkele voorbeelden van promotor sequenties staan hieronder.

6 Het hergebruik van de σ 70 –factor

7 De verschillende σ factoren hebben een verschillende specificiteit voor promotoren. Ze hebben allemaal een andere dissociatieconstante en ze komen in verschillende hoeveelheden voor in een cel. Verschillende σ –factoren

8 ρ onafhankelijke transcriptie- terminatie door middel van vorming hairpin en de aanwezigheid van een aantal AAA’s in de template streng. De DNA-RNA hybride wordt daardoor erg instabiel, waardoor het RNA van het DNA loslaat. Bij de ρ afhankelijke transcriptie- terminatie speelt het ρ-eiwit een rol bij het verbreken van de binding van het RNA met het DNA (veel meer is er niet over bekend). Terminatie van de transcriptie

9 Regulatie transcriptie bij prokaryoten Constitutieve expressie Reguleerbare genen; stimulatie of remming Een voorbeeld hiervan is de werking van het Lac-operon; een repressor blokkeert de transcriptie als er geen Lactose in het medium aanwezig is. Een enhancer versterkt de transcriptie.

10 Transcriptie bij eukaryoten Transcriptie vindt plaats in de kern Er zijn meerdere RNA Polymerases actief Er zijn veel verschillende Transcriptie Factoren (TF’s) De Promotor sequentie is anders dan bij de prokaryoten Na de transcriptie vindt processing plaats.

11 Eukaryoten hebben 3 soorten RNA polymerases:  RNA polymerase I (Pol I):pre-ribosomaal RNA (18S, 5,8S en 28S rRNA)  RNA polymerase II (Pol II):mRNA en enkele speciale kleine RNAs  RNA polymerase III (Pol III):alle tRNAs, 5S rRNA en enkele andere speciale kleine RNAs  Alle gemaakte RNAs bij elkaar vormen het Transcriptoom  Alle gesynthetiseerde RNAs worden geprocessed  RNA Pol heeft Mg 2+ nodig, Zn 2+ en dNTPs (en geen primer).  Turnover

12 Gemeenschappelijke structuren in promotoren die door Pol II worden herkend (versimpelde versie). Inr = De Promotor voor RNA Pol II Inr = initiation complex. Y = Py N = alles De transcriptie begint in of vlakbij de Inr sequentie. De regelsequenties kunnen upstream zitten, maar ook honderden nt downstream!!!!

13 Bij eukaryoten zijn twee groepen transcriptie factoren actief I: De basale transcriptie factoren – Deze zijn altijd nodig om de transcriptie te laten starten II: De specifieke transcriptie factoren – Deze factoren (eiwitten) zijn vaak specifiek voor een bepaald gen of een bepaalde groep genen – Ze verhogen de transcriptie

14 Enkele voorbeelden van transcriptie-factoren (illustratie).

15 Voorbeeld start Transcriptie eukaryotisch gen ( om de complexiteit te laten zien) (illustratie). Het COOH-uiteinde van Pol II bevat 52 x YSPTSPS

16 Enhancers of repressors kunnen de transcriptie positief of negatief beïnvloeden (frequentie van initiatie).

17 De complexiteit van de regulatie van transcriptie bij eukaryoten Transcriptional regulators can each have a different role. Combinations of one, two, or three regulators (blue, green, and yellow shapes) can affect transcription in different ways by differentially affecting a mediator complex (orange), which is also composed of proteins. The effect is that the same gene can be transcribed in multiple ways, depending on the combination, presence, or absence of various transcriptional regulator proteins. © 2010 Nature Education All rights reserved. Nature Education

18 Activerende en remmende transcriptiefactoren Er kunnen behalve activatoren ook zg. silencers actief zijn. NB: Terminatie signalen voor Pol II zijn nog niet gevonden.

19 Processing van pre-mRNA

20 Processing; de Cap structuur De Cap bestaat uit 7-methylguanosine die aan het 5’ uiteinde wordt gekoppeld via een ongebruikelijke 5’- 5’ binding.

21 De Capping meer in detail: illustratie!!

22 splicing Er zijn 4 soorten introns (50 – bp). Sommige splicen zichzelf (er zijn geen eiwitten bij betrokken). De meeste mRNA’s die in de kern worden gemaakt hebben introns die met de spliceosomen worden verwijderd. De spliceosomen bevatten verschillende snRNPs (small nuclear Ribonucleoproteins). 5 verschillende snRNA’s (U1, 2, 4, 5 en 6) en ± 50 verschillende proteins. De overgang van exon naar intron is altijd een AG/GU en van intron naar exon ook!

23 Overzicht van de verschillende processing stappen bij mRNA

24 Verdeling introns/ gen (illustratie)

25 Polyadenylering Aan de 3’-kant van het geproceste RNA worden 80 – 250 A’s geplaatst door het enzym ………. Het 5’ AAUAAA signaal wordt ook wel het poly-adenylerings signaal of het cleavage signaal genoemd. Het RNA transcript wordt 10 – 30 nt’s na dit signaal geknipt, waarna de poly- adenylering plaatsvindt. Na correcte processing gaat het RNA naar het cytoplasma om daar vertaald te worden.

26 Variatie in transcriptie Er zijn ± genen in het menselijke genoom waarvan honderden duizenden verschillende eiwitten kunnen worden gemaakt. Dat kan doordat er veel variatie mogelijk is tijdens en na de transcriptie: Alternatief promotor gebruik Alternatief poly-adenylerings signaal Alternatieve splicing RNA editing RNA processing MicroRNA Translationele frameshift NB: Er zijn ook nog genen die 1 transcript opleveren dat wordt vertaald in 1 eiwit.

27 Alternatief promotor gebruik

28 Alternatieve polyadenylering In een transcript kunnen meerdere cleavage signalen aanwezig zijn.

29 Alternatieve splicing Er zijn in het transcript meerdere 5’- of 3’- splicesites aanwezig, zodat er meerdere mogelijkheden zijn voor het splicen.

30 Een voorbeeld van weefsleafhankelijke variable splicing

31 Een overzicht van de verschillende processing variaties

32 Wat gebeurt er bij RNA editing?? Bij RNA editing worden 1 of meerdere nucleotiden in het gesynthetiseerde RNA veranderd door het afsplitsen van een amino groep van de stikstofbase of kunnen 1 of meerdere nucleotiden worden toegevoegd (insertie) of verwijderd (deletie). Het resultaat is een andere nucleotide. Inosine wordt vertaald alsof het een G is.

33 Voorbeeld RNA editing door deaminering

34 RNA editing ; deletie en/of insertie van nucleotiden In eukaryotische mitochondrien en chloroplasten. Guide-RNA’s G-U baseparing in RNA

35 Waar komt DNA tot expressie? Chromatine kan meer of minder in elkaar gedraaid zijn. Euchromatine is de minder gecondenseerde vorm van chromatine… deze vorm is actief! Heterochromatine is de meer gecondenseerde vorm van chromatine. Deze vorm is niet actief! Er vindt bv. geen transcriptie plaats!!

36 Sommige gebieden (telomeren en centromeer) zijn nooit actief. In andere gebieden kan het Chromatine ge-activeerd en ge-inactiveerd worden (van eu-chromatine naar heterochromatine). Hierbij spelen methylatie en acetylatie een belangrijke rol. Methylatie van de nucleotiden, maar ook van de histoneiwitten.

37 Beinvloeden de histonen de transcriptie? Men ging er altijd van uit dat methylering van DNA de transcriptie van DNA negatief beïnvloedde. Nu blijkt dat er een andere oorzaak moet zijn voor de inactivatie. Methylering is om “per ongeluk” transcriptie te voorkomen. Acetylering van de aa’s van de histonen beinvloedt de stapeling van de nucleosomen!!! Acetylering = activatie van de transcriptie Deacetylering = repressie

38 Methylering van DNA In DNA worden de A en de C vaker gemethyleerd dan de G en de T. Er zijn zogenaamde CpG gebieden (veel meer CG nucleotiden achter elkaar) waarbij de C vaak gemethyleerd is.

39 Afbraak van RNA In prokaryoten is de halfwaardetijd van mRNAs slechts enkele minuten. Bij eukaryoten bedraagt dat uren. De “half-life of RNA” kan worden bepaald met de Northern blot methode.

40 Hoe vindt je de promotor in het DNA? Dit kan worden bepaald met de Footprinting methode.

41 De Footprint zichtbaar maken Een Footprint van de Lac promotor

42 Processing van andere RNAs Behalve mRNA worden ook de andere RNAs na transcriptie geprocessed. Na methylering en pseudo- uridine vorming (en nog meer modificaties) vindt er splicing plaats van het pre-rRNA. snoRNP- deeltjes spelen hierbij een belangrijke rol.

43 Processing tRNA

44 MicroRNAs (miRNAs) miRNAs spelen een belangrijke rol in genregulatie. Processing van pri-miRNA door Drosha en processing van pre-RNA door Dicer nucleotiden Complementair aan (delen van) mRNA Door binding aan (3’- UTR van) mRNA wordt het mRNA afgebroken of wordt de translatie geremd = Gene silencing Duizenden miRNAs die ± 30% van de genen reguleert Sommige binden aan 1 mRNA, andere aan meerdere mRNAs siRNAs

45 Small intereference RNAs (siRNAs) Het miRNA proces kan bij experimenten nagebootst worden: Een klein RNA met hairpin (en complementair aan mRNA) wordt door Dicer herkend en geknipt. Het si-RNA bindt aan mRNA dat daardoor wordt “gesilenced”. Op deze manier kan onderzoek worden gedaan naar het effect van een genproduct zonder in dat gen mutaties aan te hoeven brengen.

46 Soorten RNAs mRNA codeert voor een eiwit Alle andere RNAs zijn ncRNAs (non-coding RNAs): – snRNA – snoRNA – rRNA – tRNA – miRNA – ………….


Download ppt "Expressie van het DNA Transcriptie (bij pro- en eukaryoten) Splicing, gewoon en alternatief RNA-editing MicroRNAs."

Verwante presentaties


Ads door Google