De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Electroforese. Hoe weet je dat de digestie gelukt is?????? Door een deel van het reactiemengsel in een agarosegel te electroforeren Door een deel van.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Electroforese. Hoe weet je dat de digestie gelukt is?????? Door een deel van het reactiemengsel in een agarosegel te electroforeren Door een deel van."— Transcript van de presentatie:

1 Electroforese

2 Hoe weet je dat de digestie gelukt is?????? Door een deel van het reactiemengsel in een agarosegel te electroforeren Door een deel van het reactiemengsel in een agarosegel te electroforeren

3 Het maken van een agarosegel Een agarose-oplossing wordt in een bepaalde buffer gemaakt. Een agarose-oplossing wordt in een bepaalde buffer gemaakt. Agarose lost pas op als de oplossing verwarmd is Agarose lost pas op als de oplossing verwarmd is Na afkoelen wordt de vloeistof in een mal gegoten Na afkoelen wordt de vloeistof in een mal gegoten Een kam zorgt ervoor dat er welletjes worden gemaakt Een kam zorgt ervoor dat er welletjes worden gemaakt Na stollen wordt de gel in een electroforesbak gelegd onder de electroforesebuffer Na stollen wordt de gel in een electroforesbak gelegd onder de electroforesebuffer De DNA monsters worden in de welletjes gepipetteerd De DNA monsters worden in de welletjes gepipetteerd De gel wordt geelectroforeerd De gel wordt geelectroforeerd

4 Agarosegel electroforese (1) Tijdens de electroforese wordt er een bepaald voltage ingesteld tussen de beide polen, waardoor in aanwezigheid van de juiste buffer een stroom gaat lopen. Tijdens de electroforese wordt er een bepaald voltage ingesteld tussen de beide polen, waardoor in aanwezigheid van de juiste buffer een stroom gaat lopen. Bij de heersende pH (pH 7.8) is het DNA negatief geladen. De fosfaatgroepen zijn hier verantwoordelijk voor Bij de heersende pH (pH 7.8) is het DNA negatief geladen. De fosfaatgroepen zijn hier verantwoordelijk voor Het DNA migreert dus naar de + pool. Het DNA migreert dus naar de + pool.

5 Agarosegel electroforese(2) De scheiding van lineaire DNA fragmenten vindt plaats op grond van de grootte. De scheiding van lineaire DNA fragmenten vindt plaats op grond van de grootte. Kleine fragmenten migreren sneller door de mazen van de agarose dan de grotere fragmenten Kleine fragmenten migreren sneller door de mazen van de agarose dan de grotere fragmenten

6 Hoe weet je nu dat de electroforese lang genoeg heeft geduurd? Je wilt zo kort mogelijk electroforeren, maar ook een zo groot mogelijke scheiding, kortom een duidelijk resultaat. Je wilt zo kort mogelijk electroforeren, maar ook een zo groot mogelijke scheiding, kortom een duidelijk resultaat. DNA in oplossing is kleurloos. Hoe kan je nu zien dat het ver genoeg geelectroforeerd heeft??? DNA in oplossing is kleurloos. Hoe kan je nu zien dat het ver genoeg geelectroforeerd heeft??? Door aan het DNA monster een opbrengbuffer met een kleurstof toe te voegen kan je het electroforeseproces volgen Door aan het DNA monster een opbrengbuffer met een kleurstof toe te voegen kan je het electroforeseproces volgen Bij deze electroforese zijn de kleurstoffen BFB en XC gebruikt als kleurmarkers. Bij deze electroforese zijn de kleurstoffen BFB en XC gebruikt als kleurmarkers.

7 De functies van de opbrengbuffer (loading buffer). De loading buffer heeft 3 functies: De loading buffer heeft 3 functies: –1: Het bevat éen of meerdere kleurstoffen zodat het DNA monster zichtbaar wordt. –2: Het bevat een zwaarmaker zodat het DNA monster in het welletje zakt –3: De kleurstoffen bewegen dezelfde kant op als het DNA. De voortgang van de electroforese is zodoende zichtbaar. Er zijn 3 kleurstoffen die veel worden gebruikt; Er zijn 3 kleurstoffen die veel worden gebruikt; Orange G migreert alsof het 10 – 20 bp lang is Orange G migreert alsof het 10 – 20 bp lang is Broomfenol blauw migreert ongeveer alsof het een DNA fragment is van 300 bp Broomfenol blauw migreert ongeveer alsof het een DNA fragment is van 300 bp Xylene cyanol migreert alsof het 4000 bp is Xylene cyanol migreert alsof het 4000 bp is

8 In de loading buffer die aan DNA wordt toegevoegd kunnen verschillende zwaarmakers worden gebruikt: In de loading buffer die aan DNA wordt toegevoegd kunnen verschillende zwaarmakers worden gebruikt: –15 % (w/v) Ficoll 400 –30 % Glycerol –40 % Sucrose

9 Hoe wordt het DNA zichtbaar in de agarosegel??? Wanneer ethidium bromide aan een DNA-oplossing wordt toegevoegd “kruipt” het tussen de baseparen. Dit wordt intercalatie genoemd. Wanneer ethidium bromide aan een DNA-oplossing wordt toegevoegd “kruipt” het tussen de baseparen. Dit wordt intercalatie genoemd. Wanneer op een EtBR-DNA complex UV straling valt licht het DNA op (fluorescentie) Wanneer op een EtBR-DNA complex UV straling valt licht het DNA op (fluorescentie) Voorkom dat Ethidium bromide in je eigen DNA terecht komt. Het kan mutaties veroorzaken. Voorkom dat Ethidium bromide in je eigen DNA terecht komt. Het kan mutaties veroorzaken.

10 Twee foto’s van agarosegels. Twee foto’s van agarosegels. Het (lineaire) DNA fragment kan vergeleken worden met een DNA ladder (marker) waarvan de lengtes van de verschillende bandjes bekend zijn. Het (lineaire) DNA fragment kan vergeleken worden met een DNA ladder (marker) waarvan de lengtes van de verschillende bandjes bekend zijn.

11 Enkele voorbeelden van referentie-ladders voor DNA

12 Het agarose % bepaalt het scheidend vermogen van de gel Wanneer dezelfde DNA ladder in Wanneer dezelfde DNA ladder in verschillende agarose % wordt geelectroforeerd ziet het resultaat eruit zoals hiernaast afgebeeld. Afhankelijk van het agarose % is er een lineair verband Afhankelijk van het agarose % is er een lineair verband tussen de loopafstand van het DNA fragment en de lengte in bp. Enkele voorbeelden staan hieronder.


Download ppt "Electroforese. Hoe weet je dat de digestie gelukt is?????? Door een deel van het reactiemengsel in een agarosegel te electroforeren Door een deel van."

Verwante presentaties


Ads door Google