De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie - ionchromatografie - affiniteitschromatografie Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC7.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie - ionchromatografie - affiniteitschromatografie Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC7."— Transcript van de presentatie:

1 Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie - ionchromatografie - affiniteitschromatografie Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC7

2 Kolom chromatografie Verschillende soorten

3 Een systeem

4

5 Chromatogram

6 Een kolom biochemistry.wur.nl/Hb/Gelfiltratie.html Stationaire fase Mobiele fase

7 Scheiding op een kolom

8 Gedrag van moleculen in een kolom adsorptie: meer neiging tot binding aan stationaire fase desorptie: minder neiging tot binding aan stationaire fase CSCS CMCM desorptie adsorptie Ideaal: verdeling lineair C s = concentratie is stationaire fase C m = concentratie in mobiele fase

9 Isothermen en piekvorm Cs Cm Cs Cm Cs Cm toenemende hoeveelheid massapiekpatroon in chromatogram desorptie adsorptie een juist evenwicht tussen stationaire fase en mobiele fase geeft een scherpe piek.

10 K K is de verdelingscoëfficiënt: waar bevindt zich een molecuul in de kolom, in C S of in C M geeft de mate van verdeling over matrix en mobiele fase weer Wet van Nernst: K = C s /C m CSCS CMCM K = C S /C M

11 De “zone”; de piek De zone is het oppervlak van de piek De zone is rechtevenredig met de concentratie

12 Kolom chromatografie Verschillende soorten

13 Gelfiltratie Kleine moleculen hebben meer tijd nodig Gelpermeatie of uitsluitingschromatografie (size exclusion chromatography)

14 De matrix voor gelfiltratie Goede elutie eigenschappen Hydrofiel karakter Geen geladen groepen Chemische resistentie Biologische resistentie Bijv. polymeren van: - acrylamide (Biogel P) - dextraan (Sephadex) - combinatie acrylamide en dextraan (Sephacryl) - agarose (Sepharose, Biogel A)

15 De volumina in een kolom V c = kolom volume V 0 = void volume (buitenvolume) V i = intern volume (binnenvolume) V m = matrix volume V e = elutie volume VmVm V c = V 0 + V i + V m groot eiwit: V e =V 0 klein eiwit: V e =V 0 +V i

16 Berekeningen met gelfiltratie V c = V 0 + V i + V m = kolomvolume = π r 2 h, hieruit de benodigde hoogte K d of K 0 = (V e - V 0 ) / V i ; (C s /C M ), verdeling over kolom K 0 : hoe groter de K 0, hoe kleiner de molmassa (M w ): K 0 nadert 0: groot molecuul. K nadert 1: kleinste moleculen (volledige distributie over V i en V 0 )

17 Toepassingen gelfiltratie Isolatie en zuivering biomoleculen (H05PBM) Molecuulmassa bepaling Ontzouten Bufferverwisseling

18 Vraagje Welke van onderstaande methoden kun je gebruiken om zout te verwijderen? Gelfiltratie Ultrafiltratie Dialyse Homogeniseren Centrifugeren

19 Meet OD 280 en geeft dit door aan recorder Verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft buiswisseling ook door aan recorder Fractieverzamelaar

20 Zuivering mbv gelfiltratie

21

22 Ionenwisselaars R-Na 2 + Ca 2+ R-Ca + 2Na + Zeolieten:- natuurlijke ionenwisselaars - aluminiumsilicaten Ionchromatografie

23 Principe scheiding

24 Matrix:- onoplosbaar - chemische resistent - biologische resistent - inert - capaciteit Spacer armvaak voor biochemische toepassingen tegengaan sterische hindering  MatrixSpacer armLigandBiomolecuul Matrix en spacer arms

25 Kationenwisselaar: - bevat negatief geladen / zure groepen (bv. Dowex-50, CM cellulose, Chelex-100) - uitwisseling positieve kationen Anionenwisselaar: - bevat positief geladen / basische groepen (bv. Dowex-1, DEAE) - uitwisseling negatieve anionen Ionogene groepen

26 Ontharding van water: kalk,Ca 2+ Na + Demineralisering van water: - verwijdering kat- en anionen - 2 ionenwisselaars (indien gemengd: mixed bed) - kationen worden vervangen door protonen - anionen worden vervangen door OH - -ionen Op lab: - demiwater, gedemineraliseerd water mbv hars kolom, vergelijkbaar met enkelvoudig gedestilleerd water - mQ of milliQ water, gedemineraliseerd water mbv Millipore kolom, soort “bidest” Toepassingen voor water

27 EiwitladingpH hoogpH laagpH neutraal Neutrale a.z Basische a.z. 0 + n+ Zure a.z. - 0 m- Netto lading - + n-m Isoëlektrisch punt (IEP): - pH waarbij de nettolading van het eiwit nul is - kan bepaald worden met isoëlektrische focussering Toepassingen voor eiwitten

28 pH boven IEP, eiwit is negatiefanionenwisselaar pH beneden IEP, eiwit is positiefkationenwisselaar pH en ionsterkte bepalen affiniteit eiwit voor kolom Grotere afwijking pH van IEPgrotere affiniteit Hoe werkt ionchromatografie bij eiwitzuivering?

29 pH wijzigen of ionsterkte verhogen Buffer en pH blijven gelijk in zoutgradiënt, alleen zoutconcentratie stijgt! [NaCl]=0[NaCl]=1 M Elutie

30 Ionchromatografie van aminozuren

31 Zuivering mbv ionchromatografie

32 Affiniteitschromatografie Zuivering gebaseerd op biologische functie of individuele structuur

33 Scheidingsprocedure

34 Affiniteit De mate van aantrekking van moleculen reversibel, dus niet covalent! 

35 Mobiele fase Stationaire fase Schone uitloop Affiniteitschromatografie

36

37 Schema affiniteitschromatografie

38  MatrixSpacer armLigandBiomolecuul

39 Inert Open structuur toegankelijk voor eiwitten om aan ligand aan matrix te kunnen binden Groot aantal chemische groepen, waaraan ligand covalent gekoppeld kan worden Goede elutie eigenschappen Chemische stabiliteit Matrix

40 Agarosekorrels Polyacrylamide korrels Poreuze glazen korrels Grote bolvormige korrels: geven interkorrel ruimtes, die geschikt zijn voor AC van grote biomoleculen zoals ribosomen, membraanfracties en zelfs intacte cellen! Voorbeelden matrix

41 Specifieke, reversibele affiniteit voor biomolecuul Bezit minstens één reactieve groep voor binding aan matrix mag niet betrokken zijn bij biologische herkenning! Oplosbaar in vloeistoffen betrokken bij koppelingsproces en bestand tegen koppelingsreacties Bindingsaffiniteit voor biomolecuul: - niet te sterk - niet te zwak - aanwezig na koppeling aan matrix Ligand

42 Tegen sterische hindering Fysisch-chemische eigenschappen van spacer arms beïnvloeden karakter matrix en affiniteit van biomolecuul voor ligand Hydrofobe spacer arms: toename aspecifieke binding Tegengaan door klein beetje organisch oplosmiddel in eluens of hydrofiele spacer arm  MatrixSpacer armLigandBiomolecuul Spacer arms

43 Voorbeelden spacer arms

44 Verandering van: pH Ionsterkte Pas op voor denaturatie biomolecuul!! Niet selectieve elutie

45 AC voor IgG-antilichamen IgG antilichamen zuiveren met Protein-A, -G of -L affiniteitschromatografie

46 Biotine Eiwitten zijn makkelijk te biotinyleren Hoge affiniteit voor streptavidine en avidine

47 Biotine gebruikt om het ligand aan de matrix te koppelen

48 Zuivering biotine- bindende eiwitten

49 Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) Zuivering van recombinant histidine gemerkte (His-tagged) eiwitten Histidine: pK is 6,5 heeft imidazole ring

50 Interactie tussen twee naburige His-aminozuren in de 6xHis-tag en de Ni-NTA-matrix. IMAC

51 Zuiveringsprocedure op Ni-NTA-Spin kolommetjes. Rode staartjes = His-tag 6 histidine aminozuren

52 IMAC

53 Zuivering van GST-fusie eiwitten Glutathione-S-Transferase


Download ppt "Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie - ionchromatografie - affiniteitschromatografie Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC7."

Verwante presentaties


Ads door Google