Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie

Presentatie over: "Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie"— Transcript van de presentatie:

1 Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie
- ionchromatografie - affiniteitschromatografie TBEMH-P05IDB HC7 Sigrid Beiboer en Ivo Horn

2 Kolom chromatografie Verschillende soorten

3 Een systeem

4 Een systeem

5 Chromatogram

6 Een kolom Mobiele fase Stationaire fase
biochemistry.wur.nl/Hb/Gelfiltratie.html

7 Scheiding op een kolom

8 Gedrag van moleculen in een kolom
Ideaal: verdeling lineair adsorptie: meer neiging tot binding aan stationaire fase adsorptie CS desorptie: minder neiging tot binding aan stationaire fase desorptie CM Cs= concentratie is stationaire fase Cm= concentratie in mobiele fase

9 Isothermen en piekvorm
een juist evenwicht tussen stationaire fase en mobiele fase geeft een scherpe piek. toenemende hoeveelheid massa piekpatroon in chromatogram Cs Cm Cs Cm desorptie Cs Cm adsorptie

10 K K is de verdelingscoëfficiënt: waar bevindt zich een molecuul in de kolom, in CS of in CM geeft de mate van verdeling over matrix en mobiele fase weer Wet van Nernst: K = Cs/Cm CS CM K = CS/CM

11 De “zone”; de piek De zone is het oppervlak van de piek
De zone is rechtevenredig met de concentratie

12 Kolom chromatografie Verschillende soorten

13 Gelfiltratie Gelpermeatie of uitsluitingschromatografie (size exclusion chromatography) Kleine moleculen hebben meer tijd nodig

14 De matrix voor gelfiltratie
Goede elutie eigenschappen Hydrofiel karakter Geen geladen groepen Chemische resistentie Biologische resistentie Bijv. polymeren van: acrylamide (Biogel P) dextraan (Sephadex) combinatie acrylamide en dextraan (Sephacryl) agarose (Sepharose, Biogel A)

15 De volumina in een kolom
Vc = kolom volume V0 = void volume (buitenvolume) Vi = intern volume (binnenvolume) Vm= matrix volume Ve= elutie volume Vm Vc = V0 + Vi + Vm groot eiwit: Ve=V0 klein eiwit: Ve=V0+Vi

16 Berekeningen met gelfiltratie
Vc = V0 + Vi + Vm = kolomvolume = π r2 h, hieruit de benodigde hoogte Kd of K0 = (Ve - V0) / Vi ; (Cs/CM), verdeling over kolom K0: hoe groter de K0, hoe kleiner de molmassa (Mw): K0 nadert 0: groot molecuul. K nadert 1: kleinste moleculen (volledige distributie over Vi en V0)

17 Toepassingen gelfiltratie
Isolatie en zuivering biomoleculen (H05PBM) Molecuulmassa bepaling Ontzouten Bufferverwisseling

18 Vraagje Welke van onderstaande methoden kun je gebruiken om zout te verwijderen? Gelfiltratie Ultrafiltratie Dialyse Homogeniseren Centrifugeren

19 Fractieverzamelaar Meet OD280 en geeft dit door aan recorder
Verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft buiswisseling ook door aan recorder

20 Zuivering mbv gelfiltratie

21 Zuivering mbv gelfiltratie

22 Ionchromatografie Ionenwisselaars
R-Na Ca2+ R-Ca Na+ Zeolieten: - natuurlijke ionenwisselaars - aluminiumsilicaten

23 Principe scheiding

24 Matrix en spacer arms  Matrix: - onoplosbaar - chemische resistent
- biologische resistent - inert - capaciteit Spacer arm vaak voor biochemische toepassingen tegengaan sterische hindering  Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

25 Ionogene groepen Kationenwisselaar:
- bevat negatief geladen / zure groepen (bv. Dowex-50, CM cellulose, Chelex-100) - uitwisseling positieve kationen Anionenwisselaar: - bevat positief geladen / basische groepen (bv. Dowex-1, DEAE) - uitwisseling negatieve anionen

26 Toepassingen voor water
Ontharding van water: kalk, Ca2+ Na+ Demineralisering van water: - verwijdering kat- en anionen - 2 ionenwisselaars (indien gemengd: mixed bed) - kationen worden vervangen door protonen - anionen worden vervangen door OH--ionen Op lab: demiwater, gedemineraliseerd water mbv hars kolom, vergelijkbaar met enkelvoudig gedestilleerd water mQ of milliQ water, gedemineraliseerd water mbv Millipore kolom, soort “bidest”

27 Toepassingen voor eiwitten
Eiwitlading pH hoog pH laag pH neutraal Neutrale a.z Basische a.z n+ Zure a.z m- Netto lading n-m Isoëlektrisch punt (IEP): pH waarbij de nettolading van het eiwit nul is kan bepaald worden met isoëlektrische focussering

28 Hoe werkt ionchromatografie bij eiwitzuivering?
pH boven IEP, eiwit is negatief anionenwisselaar pH beneden IEP, eiwit is positief kationenwisselaar pH en ionsterkte bepalen affiniteit eiwit voor kolom Grotere afwijking pH van IEP grotere affiniteit

29 Elutie pH wijzigen of ionsterkte verhogen [NaCl]=0 [NaCl]=1 M
Buffer en pH blijven gelijk in zoutgradiënt, alleen zoutconcentratie stijgt!

30 Ionchromatografie van aminozuren
Al in eerder IDB college van Wd gehad

31 Zuivering mbv ionchromatografie

32 Affiniteitschromatografie
Zuivering gebaseerd op biologische functie of individuele structuur

33 Scheidingsprocedure

34 Affiniteit De mate van aantrekking van moleculen reversibel, dus niet covalent! 

35 Affiniteitschromatografie
Mobiele fase Stationaire fase Schone uitloop

36

37 Schema affiniteitschromatografie

38  Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

39 Matrix Inert Open structuur toegankelijk voor eiwitten om aan ligand aan matrix te kunnen binden Groot aantal chemische groepen, waaraan ligand covalent gekoppeld kan worden Goede elutie eigenschappen Chemische stabiliteit

40 Voorbeelden matrix Agarosekorrels Polyacrylamide korrels
Poreuze glazen korrels Grote bolvormige korrels: geven interkorrel ruimtes, die geschikt zijn voor AC van grote biomoleculen zoals ribosomen, membraanfracties en zelfs intacte cellen!

41 Ligand Specifieke, reversibele affiniteit voor biomolecuul
Bezit minstens één reactieve groep voor binding aan matrix mag niet betrokken zijn bij biologische herkenning! Oplosbaar in vloeistoffen betrokken bij koppelingsproces en bestand tegen koppelingsreacties Bindingsaffiniteit voor biomolecuul: niet te sterk niet te zwak aanwezig na koppeling aan matrix

42 Spacer arms  Tegen sterische hindering
Fysisch-chemische eigenschappen van spacer arms beïnvloeden karakter matrix en affiniteit van biomolecuul voor ligand Hydrofobe spacer arms: toename aspecifieke binding Tegengaan door klein beetje organisch oplosmiddel in eluens of hydrofiele spacer arm  Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

43 Voorbeelden spacer arms

44 Niet selectieve elutie
Verandering van: pH Ionsterkte Pas op voor denaturatie biomolecuul!!

45 AC voor IgG-antilichamen
IgG antilichamen zuiveren met Protein-A, -G of -L affiniteitschromatografie

46 Biotine Hoge affiniteit voor streptavidine en avidine
Eiwitten zijn makkelijk te biotinyleren

47 Biotine gebruikt om het ligand aan de matrix te koppelen

48 Zuivering biotine-bindende eiwitten
Nadeel van biotine elutie hier is, dat je eiwit niet volledig zuiver is. Er zit immers nog biotine aan.

49 Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)
Zuivering van recombinant histidine gemerkte (His-tagged) eiwitten Histidine: pK is 6,5 heeft imidazole ring

50 IMAC Interactie tussen twee naburige His-aminozuren in de 6xHis-tag en de Ni-NTA-matrix.

51 Rode staartjes = His-tag 6 histidine aminozuren
IMAC Elution Buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 250 mM NaCl, 300 mM imidazole, 0.05 % Tween 20, 0.02 % NaN3 Imidazole lijkt op histidine en competeert de histag van de kolom Zuiveringsprocedure op Ni-NTA-Spin kolommetjes.

52 IMAC

53 Zuivering van GST-fusie eiwitten
Glutathione-S-Transferase