De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Eiwitzuivering 1 Werken met eiwitten Homogenisatie Detergentia Centrifugatie Zoutprecipitatie Dialyse TBEMH-P05IDB HC5 Sigrid Beiboer en Ivo Horn.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Eiwitzuivering 1 Werken met eiwitten Homogenisatie Detergentia Centrifugatie Zoutprecipitatie Dialyse TBEMH-P05IDB HC5 Sigrid Beiboer en Ivo Horn."— Transcript van de presentatie:

1 Eiwitzuivering 1 Werken met eiwitten Homogenisatie Detergentia Centrifugatie Zoutprecipitatie Dialyse TBEMH-P05IDB HC5 Sigrid Beiboer en Ivo Horn

2 Eiwitzuivering volgen op gel Hoe zuiverder het eiwit, des te minder bandjes op gel

3 Eiwitzuivering volgen door enzymatische activiteit Hoe zuiverder het enzym (=eiwit), des te hoger zijn specifieke activiteit

4 Werken met eiwitten Invloed temperatuur Invloed pH = werken op ijs!!!!

5 Temperatuur verhoging geeft: - Afname H-bruggen - Toename hydrofobe interacties tot 60ºC, daarna afname - Ontvouwen en expansie van eiwit - Disulfide uitwisseling - Eiwit aggregatie Eiwitten ‘au bain marie’ verwarmen Invloed temperatuur

6 Hoe meer pH van oplossing afwijkt van pI van eiwit: - Toename lading van eiwit - Ontvouwen en expansie van eiwit - Disulfide uitwisseling - Eiwit aggregatie Eiwitten lossen beter in buffer op dan in water Toevoegen loog of zuur: voorzichtig! En bij voorkeur < 0,2 N Invloed pH

7 Maken eiwitten meer compact Voorbeelden: - Glycerol - Sucrose - Zouten: NaCl, (NH 4 )SO 4 - MPD (2-methyl-2,4-pentaandiol): kristallisatie Stabiliserende stoffen

8 - In droge vorm bij 4ºC Voor gebruik op KT laten komen! - In oplossing (niet te lage concentratie!): - bij 4ºC (lange tijd: NaN 3 of filter steriliseren) - bij -20ºC of -80ºC (moet eiwit wel tegen kunnen!) Bewaren van eiwitten

9 Eiwitten zijn zeer gevoelig; werken met eiwitten is lastiger dan met DNA Werk daarom altijd op ijs!

10 De verschillende stappen voor een eiwitisolatie uit biologisch materiaal: Weefsel homogeniseren Scheiden van bestanddelen Isoleren van biomoleculen Identificeren van biomoleculen

11 Waarom homogeniseren bij biochemische methoden? Weefsel geschikt maken voor verdere behandeling Fijn maken van materiaal Eerste stap in de procedure van orgaan/weefsel tot molecuul

12 Verschillende homogenisatie methodes BlenderenBlender Drukpers French Press Teflon of Potter- Elvehjem homogenisator SonificerenSonificator Vriezen / ontdooienVriezer of mengsel van droogijs/ethanol VermalenStamper en mortier Enzymatisch / osmose Zie ook Wilson & Walker §8.3.3 en Campbell & Farrell §5.1

13 Verschillende systemen Geheel intact stuk weefsel/orgaan (vb. spier, lever, hart) Biologische vloeistof (vb. bloed) Biopt Eukaryote cellen in kweek Bacteriën, gisten, schimmels

14 Blenderen Grof weefsel snijden/hakken Voorbehandeling Redelijke homogenisatie

15 Teflon homogenisator (Potter-Elvehjem) Glazen buis met teflon stamper Onder druk cellen tegen de wand van de buis drukken Cellen springen open, moleculen in oplossing Moleculen isoleren (centrifugeren) Zeer goede, voorzichtige methode (celorganellen blijven intact)

16 French press Celsuspensie in cilinder Hoge druk toepassen Cellen springen kapot Isolatie van vloeistof Centrifugatie om celdebris te scheiden van vloeistof met moleculen

17 Sonificeren Omzetting voltage in elektrische energie (20 kHz, ultrasone trillingen) Omzetting naar mechanische trillingen via probe In de vloeistof: holtes en implosies Schokgolf, destructie cellen Bacteriën, eukaryote cellen, weefsel Let op: verhitting! Altijd koelen ivm aanwezig eiwit

18 Mortieren Vermalen tussen glas- of aluminiumpoeder Geschikt voor kleine hoeveelheden bacteriën of gistcellen Mortieren op ijs!

19 Osmotisch zwellen en/of enzymatisch Hoge molariteit Osmotische zwelling cellen Cellen barsten open Sucrose/glucose EDTA helpt (desintegratie membraaneiwitten) Enzym lysozym Detergens: Triton X-100, ureum,..

20 Detergens als hulpmiddel Triton X-100 Ureum Guanidine-HCl SDS ß-mercaptoëthanol Dithiothreitol (DTT)

21 Ureum en guanidine Ureum vermindert hydrofobe interacties en verbreekt waterstofbruggen Guanidine-HCl werkt als ureum, maar sterker

22 Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Anionisch detergent, bij KT bewaren (koude precipiteert SDS!) Geeft eiwit een negatieve lading SDS ontvouwt eiwitten, maar denatureert ze niet volledig!

23 Detergentia

24 Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Hitte (5’, 95ºC) bevordert ontvouwing

25 Volledige eiwit denaturatie Opkoken van monster met ß-mercaptoëthanol of DTT: dit zijn sterk reducerende stoffen, die zwavelbruggen verbreken bevorderen oplosbaarheid eiwit voorkomt aggregatie analyse subeenheden mogelijk

26 Vraagje: Waarom worden detergentia gebruikt?

27 Na de homogenisatie? Verder met centrifugeren Uitzouten Dialyseren Kolomisolatie Analyse middels SDS-PAGE of blot

28 Centrifugeren: waarom? Verwijdering niet opgeloste stoffen Scheiding deeltjes op grootte of dichtheid Isolatie, zuivering en/of karakterisering biomoleculen

29 Hoe sneller de centrifuge draait Hoe hoger het aantal rounds per minute (rpm) Hoe sneller het water uit je was centrifugeert Hoe sneller je was droog is Centrifuge snelheid

30 Diameter beïnvloedt centrifuge proces Toename diameter Toename sedimentatiesnelheid bij gelijk aantal rpm Diameter centrifuge rotor

31 Versnelling van het deeltje, a = (2·  ·n/60) 2 ·r (Wilson & Walker: centrifugale veld, G) Toerental, n: aantal rounds per minute (rpm) F = m·a a =  2 ·r Snelheid van het deeltje, v =  · r Centrifuge proces

32 n: toerental in rpm r: straal in meter n 2 = n 1 √(r 1 /r 2 ) Hoe groter de straal, hoe lager het toerental om dezelfde sedimentatiesnelheid te krijgen. Bijvoorbeeld: bij een straal r1 = 50 mm en een straal r2 = 100 mm is toerental n1 = 1000 rpm en toerental n2 = 707 rpm Relatie toerental / straal

33 Relatieve centrifugale versnelling, RCF; het aantal malen g dat bereikt wordt. Hierin wordt de centrifugering vaak uitgedrukt. Hoe reken je dan om? Versnelling van het deeltje: a = (2·  ·n/60) 2 ·r = (2·  ·n/60) 2 ·r/9,81 (1 g = 9,81 m/s 2 ) RCF...

34 RCF = 11,18·r·(n/1000) 2 (Straal r is hier in centimeters) Nomogram RPMRCF

35 Centrifugeren als scheidingsmethode Differentiële centrifugering of pelletering Dichtheidsgradiënt centrifugering

36 Voorbeelden Differentiële centrifugering of pelletering: ◦ afdraaien van cellen uit je celkweek ◦ DNA of RNA precipitatie met ethanol of isopropanol Dichtheidsgradiënt centrifugering zonder gradiënt: ◦ Fenol extractie ◦ Bloed

37 Scheiding van: - RNA van DNA - nucDNA van mtDNA CsCl gradiënt (Isopycnisch: met gradiënt)

38 Verticaal Vaste hoek Uitzwaai Rotoren

39 Vaste hoek vs. Uitzwaai (hoekrotor en “swingout”): Deeltjes bevinden zich verder van het middelpunt van de rotor snellere sedimentatie in hoekrotor Rotoren

40 Bij grote centrifuges geldt: Tarreren: - buizen, inclusief dop, met zelfde gewicht tegenover elkaar in de rotor - tot 0,1 g nauwkeurig Vullen: buizen met dop minimaal voor 2/3e vullen, anders implosie gevaar! Logboek bijhouden Rotorbalans: erg belangrijk!

41 Symmetrie Vaste hoek rotor Uitzwaai rotor 50 ml buizen

42 10 ml buizen Goed!Fout! Symmetrie in uitzwaai rotor

43 In- en uitzouten Eiwitten hebben beetje zout nodig om op te lossen: ◦ Inzouten Eiwitten slaan neer bij verhoging zoutconcentratie: ◦ Uitzouten Zoutconcentratie nodig voor eiwitprecipitatie, is voor elk eiwit anders

44 Zoutprecipitatie Neerslaan eiwit door verhoging zoutconcentratie Ammoniumsulfaat precipitatie ((NH 4 ) 2 SO 4 ) Alle eiwitten reageren verschillend op verschillende concentraties zouten ◦ kleinere eiwitten en eiwitten met meer geladen aminozuren lossen beter op Afdraaien (centrifugeren) ◦ Geprecipiteerd eiwit zit in pellet en overige eiwitten in supernatant Fractionele precipitatie

45 Zoutprecipitatie A280: Absorptie van eiwit bij 280 nm in spectrofotometer

46 Zoutprecipitatie Waar is het enzym en waar de overige eiwitten?

47 Voor verwijdering van zout of kleine organische moleculen Dialyse

48 Diffusie

49 Dialyse-membraan Semipermeabel Verschillende porie grootte (zowel in 1 membraan als tussen verschillende membranen) Soms voorbehandeling nodig met NaHCO 3 en EDTA Vb. Cellulose

50 Ultrafiltratie Centricon Advantec


Download ppt "Eiwitzuivering 1 Werken met eiwitten Homogenisatie Detergentia Centrifugatie Zoutprecipitatie Dialyse TBEMH-P05IDB HC5 Sigrid Beiboer en Ivo Horn."

Verwante presentaties


Ads door Google