De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Eiwitzuivering 2 Kwantificeren van eiwitten PAGE en SDS-PAGE Iso-electric focussing 2D PAGE Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC6.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Eiwitzuivering 2 Kwantificeren van eiwitten PAGE en SDS-PAGE Iso-electric focussing 2D PAGE Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC6."— Transcript van de presentatie:

1 Eiwitzuivering 2 Kwantificeren van eiwitten PAGE en SDS-PAGE Iso-electric focussing 2D PAGE Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC6

2 Kwantificering OD 280 of A 280 Kleuring door complexvorming Spectrofotometrische bepalingen: waarden tussen 0,1 en 1,0!!!!!!!!!!!! blanco stellen met buffer

3 Kwantificering, OD 280 Eiwit absorbeert specifiek bij 280 nm Tyr en Trp en in mindere mate Phe (Y, W en F) pH en T hebben invloed op absorptie Abs. 220 en lager: peptideband in eiwit Afhankelijk van aantal az met ringstructuur!

4 Kwantificering dmv kleuring Meestal in mg/ml, tenzij precies de code bekend is (dan in molair) Kleuring door complexvorming, vb: ◦ Bradford ◦ Biureet reactie ◦ Folin-Lowry ◦ BCA

5 Kwantificering, Bradford Binding Coomassie Brilliant Blue G-250 aan eiwit Rood, na binding in zuur milieu blauw Meting bij 595 nm Bindt niet i.a.v. bepaalde detergentia, bijv deoxycholaat, triton X-100, NP-40

6 Kwantificering, Biureet reactie Koperionen binden aan peptidebanden Reductie Cu 2+ naar Cu + OD 545 Onafhankelijk van soort aminozuren

7 Kwantificering, Folin-Lowry Biureetreactie gevolgd door reductie van fosfomolybdaat door Y, W, C, H en peptidebanden Blauwe kleur bij 745 nm Zeer nauwkeurig

8 BCA bepaling Principe gelijk aan Lowry Door bicinchoninic acid veel gevoeliger Minder gevoelig voor detergentia OD 562 en lineair tot OD 562 =2

9 Elektroforese, scheiding van eiwitten Moleculaire zeef in gel

10 PAGE: polyacrylamide gel elektroforese Polymerisatie van acrylamide met N,N’-methyleen bisacrylamide mbv katalysator

11 Percentage crosslinker (bisacrylamide) % Crosslinks bepaalt mechanische eigenschappen gel en gemiddelde diameter van de poriën Meestal stockoplossing van acrylamide : bisacrylamide = 29,2 : 0,8 Stockoplossing wordt gefiltreerd (0,4 um) en in donker bij 4ºC bewaard poriediameter

12 Percentage totaal acrylamide Marker: 1.Myosin, 205 kDa 2.Beta-galactosidase, 116 kDa 3.Phosphorylase, B 92 kDa 4.BSA, 66 kDa 5.Egg albumin, 45 kDa 6.Carbonic anhydrase, 29 kDa Grote eiwittenlaag percentage acrylamide Kleine eiwittenhoog percentage acrylamide (Dalton is gewicht proton)

13 Katalysatoren 10% ammoniumpersulfaat (10% APS, bij -20ºC bewaren) en N,N,N’,N’-tetramethyleendiamine (TEMED, donker bewaren bij 4ºC) Aard van katalysator heeft invloed op poriediameter Concentratie van katalysator heeft invloed op structuur van de gel

14 Continue buffersysteem 1 gel, 1 buffer Geen concentrering van eiwitten, dikkere bandjes ◦ Kan een beetje voorkomen worden door:  sucrose vlak voor monster oplading op de gel op te brengen  kleinere ionen uit het monster te halen (dialyse) Betere scheiding door eerst met laag voltage en later met hoog voltage te elektroforeren

15 PAGE met discontinue pH Een discontinu systeem bestaat uit 2 gellagen: Stacking gel: 3% acrylamide, gel met grote mazen. Monster wordt geconcentreerd en eiwitten gerangschikt naar hun mobiliteit Separation / running gel: ±10% acrylamide, gel met kleine mazen, waarin scheiding plaats vindt KathodeAnode Tris + Glycine - pH 8,3 Elektrodevat Tris + Cl - pH 6,8 Stacking gel Tris + Cl - pH 8,8 Running gel Glycine pK aminogroep: 9,8 pK carboxylgroep: 2,4 IEP: (9,8 + 2,4)/2 = 6,1

16 pH monsterbuffer en stacking gel zijn gelijk (6,8) IEP van glycine is 6,1geringe negatieve nettolading traagste elektrolyt in stacking gel Kleine Cl - ion is leidend elektrolyt Hiertussen liggen de mobiliteiten van de eiwitten Rangschikking van eiwitten naar mobiliteit Eiwitzones concentreren zich Buffers met verschillende pH regelen de mobiliteit van de elektrolyten Grensvlak stacking en running geltoename pH tot 8,3 van elektroforesebuffer Running gel heeft kleine poriën en lage potentiaalgraad: migratiesnelheid van eiwitten neemt sterk af Glycine bij grensvlak:- toename in dichtheid running gel - pH stijging naar 9,5 (glycine wordt sterk negatief) - mobiliteit van glycine neemt sterk toe Scheiding van eiwitten door moleculaire zeefwerking

17 SDS-PAGE SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (Laemmli) SDS geeft eiwitten een negatieve lading Scheiding van eiwitten op molecuulmassa Molecuulmassa bepaling van eiwitten mbv marker Indicatie aantal en hoeveelheid van eiwit (subeenheden) in een monster

18 PAGE van IgG moleculen (antilichamen) Totaal 150 kDa 2 zware ketens van elk 50 kDa 2 lichte ketens van elk 25 kDa (1 dalton = massa 1 proton) Bevat zwavel bruggen tussen: de zware ketens de zware en lichte ketens Natieve PAGE: een brede zone SDS-PAGE: een bandje van 150 kDa SDS-PAGE + DTT: 2 bandjes van 25 kDa en 2 bandjes van 50 kDa

19 SDS-PAGE van IgG moleculen

20 SDS-PAGE Biorad minigel systeem

21 Gieten van de gel en runnen Pouring the gel Running the gel SDS PAGE op youtube:

22 Gel cassette in elkaar zetten

23 Gieten van de gel

24 Elektroforese cassette

25 Monster laden op gel Sample buffer bevat de volgende stoffen: Broomfenolblauw: hoge mobiliteit, detecteert migratie bufferfront Glycerol: eiwitdaling in slotje SDS Tris buffer pH 6,8

26 Elektroforeren Gel wordt gerund bij 40 mA of 100 V

27 Fixatie en kleuring Kleurmethoden: Coomassie Brilliant Blue R250 (CBB), hergebruik mogelijk ◦ CBB in water/methanol/ijsazijn (detectiegrens is 0,2-0,5 ug eiwit) ◦ Snellere, groffere, slechtere kleuring: CBB in trichloorazijnzuur ◦ Ontkleuring met isopropanol of methanol in azijnzuur Zilverkleuring ◦ 10 tot 100 x gevoeliger dan CBB ◦ Kleuring niet voor alle eiwitten lineair met concentratie Fluorescerende labels aan eiwitten gekoppeld Radioactieve labels aan eiwitten gekoppeld Immunologische detectie (Western blot) Detectie van enzymen (in H05PBM: 4CIN/waterstofperoxide oplossing  toont alleen peroxidase enzym aan) Fixatie om bandverbreding door diffusie tegen te gaan

28 Resultaat coomassie kleuring

29 Resultaat zilverkleuring

30 Overige kleuring manieren Radioactiviteit4CIN/waterstofperoxide oplossing toont peroxidases uit verschillende groenten (H05PBM)

31 Vraagje Welke moleculen uit een cel kunnen worden gedetecteerd op SDS-PAGE? Alleen eiwitten van interesse Alle eiwitten Zowel eiwitten als DNA Alles: eiwitten, DNA en overig celmateriaal

32 Isoëlektrisch punt, IEP of pI pH waarbij nettolading van eiwit nul is IEP of pI is afhankelijk van: - aminozuursamenstelling - volgorde van aminozuren

33 Isoëlektrische focussering pH gradiënt over gel aangebracht Samples worden op gel geladen pH op opbrengplek: –pH > pI eiwit: eiwit negatief: migreert naar positieve anode –pH < pI eiwit: eiwit positief: migreert naar negatieve kathode Migratie van eiwit stopt op die plek waarbij pH = pI Marker mee om pI te bepalen

34 Instelling gradiënt Anode6H 2 OO 2 + 4H 3 O + + 4e - Kathode4H 2 O + 4e - 2H 2 + 4OH - Verschillende amfolyten worden op gel gebracht KathodeAnode Elektroforesegradiënt stelt zich in lineaire pH gradiënt

35 pH bereik Scherpe pH-overgangen aan uiteinden van de gel: bereik van gradiënt komt niet overeen met pH-waarden van de elektrode oplossingen

36 Aandachtspunten Amfolytconcentratie > 2% Amfolyten mogen niet meekleuren –zonodig verwijderen met 5% TCA Spanning (V) zo hoog mogelijk instellen na instelling pH gradiënt, runnen op constant vermogen (bijv. 30 Watt)

37 Voorbeeld Isoëlektrische focussering

38 2D-elektroforese 1. Isoëlektrische focussering 2. SDS-PAGE

39 Resultaat 2D-elektroforese Via en SWISS-2DPAGE nog meerhttp://us.expasy.org

40 Welk eiwit? Marker nodig Afstanden meten; schatten visueel Computer software Internet database Vergelijkbare 2D gels

41 Bepaling molmassa of pI mbv afstanden meten

42

43

44

45

46 Wilson & Walker, Campbell & Farrell 7e editie H5: H5: 5.4 lezen 7e editie H3: H8: H & H11: , , & W&W H11 gaat over chromatografie, wat in IDB HC7 wordt behandeld


Download ppt "Eiwitzuivering 2 Kwantificeren van eiwitten PAGE en SDS-PAGE Iso-electric focussing 2D PAGE Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC6."

Verwante presentaties


Ads door Google