De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

1 Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne OP PUNT STELLING EN VALIDATIE VAN EEN CREATINE KINASE BEPALING Thijs Decuyper O.l.v. Dr. D. Bernard en.

Verwante presentaties


Presentatie over: "1 Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne OP PUNT STELLING EN VALIDATIE VAN EEN CREATINE KINASE BEPALING Thijs Decuyper O.l.v. Dr. D. Bernard en."— Transcript van de presentatie:

1 1 Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne OP PUNT STELLING EN VALIDATIE VAN EEN CREATINE KINASE BEPALING Thijs Decuyper O.l.v. Dr. D. Bernard en ABO E. Verhoye

2 2 Theoretisch gedeelte 1. Neonatale screening 2. De ziekte van Duchenne INHOUDSOPGAVE 3. Enzymatische creatine kinase bepaling 4. Op punt stellen van de methode 5. Validatie van de gekozen methode 6. Besluit en discussie Praktisch gedeelte

3 3 Theoretisch gedeelte 1. Neonatale screening 2. De ziekte van Duchenne 3. Enzymatische creatine kinase bepaling

4 4 Neonatale screening  Opsporen aangeboren aandoeningen  Voorwaarden voor neonatale screening Voorwaarden  11 aandoeningen opgespoord 11 aandoeningen  Via hiel- of handrugprik 1. Neonatale screening

5 5 Voorwaarden  de ziekte dient ernstig te zijn ;  niet tijdig klinisch herkend te worden;  frequent in de bevolking voorkomen;  betrouwbare, eenvoudige en goedkope test beschikbaar;  de test moet aanvaardbaar zijn voor de patiënt en/of zijn ouders;  er moeten methoden beschikbaar zijn voor de definitieve diagnose;  Er moet een efficiënte behandeling die een substantiële verandering in de levenskwaliteit met zich meebrengt zijn. 1. Neonatale screening

6 6 Opgespoorde aandoeningen  Hyperfenylalaninemie of fenylketonurie  Congenitale hypothyreoïdie  Congenitale bijnierschorshyperplasie (CAH of adrenogenitaal syndroom  MCAD deficiëntie  MMA of methylmalonacidemie  Glutaaracidurie type 1  MSUD of maple syrup urine disease  IVA of geïsoleerde isovaleriaanzuuracidemie  Biotinidasedeficiëntie  Propionzuur acidemie  MADD of glutaaracidurie type II 1. Neonatale screening

7 7 Duchenne’s spierdystrofie (DMD)  X-gebonden recessief overgeërfde spierziekte  Gen dystrofine op Xp21  Bijna alleen bij jongens  Incidentie 1/3500 – 4000  Geen dystrofine aanmaak  spierschade bij elke samentrekking (CK vrijstelling)  Pseudohypertrofie  spiercellen verdwijnen  vet- en bindweefsel 2. De ziekte van Duchenne

8 8 Duchenne’s spierdystrofie (DMD)  Leeftijd bij sterven: ongeveer 20 jaar  Supportieve therapie is mogelijk (fysiotherapie, …)  Curatieve therapie is de toekomst (exon skipping) 2. De ziekte van Duchenne

9 9 Creatine kinase  CK vrij, door spiercelnecrose  20 tot 100 x verhoogd  Creatine kinase katalyseert  Klassieke CK bepaling via UV-spectrofotometrie en op plasma (NU: vol bloed + hemolyse) 3. Enzymatische creatine kinase bepaling ATP + creatine  ADP + fosfocreatine

10 10 Creatine kinase  Enzymatische creatine kinase bepaling door middel van fluorometrie (NADPH)  Het signaal van NADPH is recht evenredig met [CK]  golflengten van ex.= 355 nm en em.= 460 nm  Interferenties (adenylaatkinase,...) 3. Enzymatische creatine kinase bepaling creatine fosfaat + ADP creatine + ATP glucose + ATP glucose-6-P + ADP glucose-6-P + NADP + gluconate-6-P + NADPH + H +

11 11 Praktische gedeelte 1. Op punt stellen van de methode 2. Validatie van de gekozen methode Gebruikte stalen in het praktische gedeelte zijn gespotte bloedstalen op bloedkaarten. (zelf aangemaakt of screeningskaarten van pasgeborenen).

12 12 Eenstapsreactie Eenstapsmethode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren

13 13 Op punt stellen van de methode Verhouding reagens/ethanol volume Verschil in incubatietijden/temperaturen Centrifugeren Fluorescentie versus UV aflezing Verschil in natriumfluoride concentraties Heparine standaarden versus EDTA standaarden Blanco’s vergelijken Eenstapsreactie versus tweestapsreactie 4. Op punt stellen van de methode

14 14 Verhouding reagens/ethanol volume 4. Op punt stellen van de methode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren Geteste verhoudingen: 75/75 en 75/150 Interpretatie: ½ verhouding beter, ethanol: reactie stoppen + eiwitneerslag

15 15 Verschil in incubatietijden/temperaturen 4. Op punt stellen van de methode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren Geteste verschillen: 30 minuten op 30 °C 20 minuten op 35 °C Interpretatie: 30 min op 30°C is de beste optie. CK kan beter elueren, meer CK die vrijkomt.

16 16 Centrifugeren 4. Op punt stellen van de methode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren Geteste verschillen: meten na alcoholprecipitatie, na centrifugeren en niet centrifugeren Interpretatie: Betere resultaten voor het centrifugeren. Echter, door quenching beter resultaten verwacht na centrifugeren. Mogelijke verklaring: verdamping van ethanol

17 17 Fluorescentie versus UV aflezing 4. Op punt stellen van de methode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren Geteste verschillen: aflezen met fluorometer en UV-spectrofotometer. Interpretatie: Het is beter om met fluorometrie te meten. Eliminatie van doorzuigstap of pipeteerstap.

18 18 Verschil in natriumfluoride concentraties 4. Op punt stellen van de methode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren Geteste verschillen: 25 mmol/L, 125 mmol/L en 250 mmol/L. Interpretatie: Het is beter om met 250 mmol/L NaF te werken voor de betere inhibitie van adenylaatkinase.

19 19 Heparine standaarden versus EDTA standaarden 4. Op punt stellen van de methode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren Geteste verschillen: Heparine standaarden en EDTA standaarden. Interpretatie Het is beter om met EDTA gewassen standaarden te werken. CK oplossing niet goed verspreid ondanks het vele mengen.

20 20 Blanco’s vergelijken 4. Op punt stellen van de methode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer Plaat centrifugeren Geteste verschillen: EDTA gespotte blanco’s en ongespotte blanco’s. Interpretatie: Het is beter om met de ongespotte blanco’s te werken aangezien deze onmogelijk CK bevatten.

21 21 Eenstapreactie versus tweestapsreactie Eenstapsmethode PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat schudden + incubatie µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

22 22 Eenstapreactie versus tweestapsreactie Tweestapsreactie PUNCHEN bloedkaarten + 50 µL reagens A (R1 + NaF) Plaat schudden + pre-incubatie Millipore plaatafzuigsysteem + werkreagens B (75 µL R2) Aflezen met fluorometer Incubatie zonder schudden µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Geteste verschillen: Eenstapsreactie en tweestapsreactie. Interpretatie: Het is beter om met de tweestapsreactie te werken. Beter elueren + reactivatie in pre-incubatiestap.

23 23 Besluit Betere resultaten met: -½ reagens/ethanol verhouding -30 minuten op 30°C -zonder centrifugeren -Fluorescentie aflezing -250 mmol/L NaF -EDTA standaarden -Ongespotte blanco’s -Tweestapsreactie 4. Op punt stellen van de methode

24 24 Tweestapsreactie PUNCHEN bloedkaarten + 50 µL reagens A (R1 + NaF) Plaat schudden + pre-incubatie Millipore plaatafzuigsysteem + werkreagens B (75 µL R2) Aflezen met fluorometer Incubatie zonder schudden µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan

25 25 Validatie van de methode Intra-run Between-run Juistheid Eigen referentiewaarden Reproduceerbaarheid externe controles Meetbereik Lineariteit Stabiliteit 5. Validatie van de gekozen methode

26 26 Intra-run Werkwijze 1 staal 21 x meten in 1 run concentratiecounts Gemiddelde SD CV% 9 4 Interpretatie: CV% onder 10 %. 5. Validatie van de gekozen methode

27 27 Between-run Werkwijze 1 staal over 21 runs 1 x meten in elke run concentratiecounts Gemiddelde SD CV% 9 9 Interpretatie: CV% onder 10 %. 5. Validatie van de gekozen methode

28 28 Juistheid Werkwijze CDC waarde vergelijken met de zelf gemeten waarde Interpretatie: Correlatie moet 1 benaderen (0,991). Positieve bias door zelf gemaakte standaarden => geen kwantitatief meting mogelijk. Geen externe standaarden internationaal beschikbaar. 5. Validatie van de gekozen methode

29 29 Eigen referentiewaarden Werkwijze 698 stalen screenen en uitzetten in histogram Aantal gescreend: 698 Gemiddelde counts: 2231 SD:356 99ste percentieel: 3179 Interpretatie: 99ste percentieel: 3179 counts Gemiddelde + 3 SD: 4722 counts 5. Validatie van de gekozen methode

30 30 Reproduceerbaarheid van externe controles Werkwijze Vergelijken van CDC controles over 21 verschillende runs CV% Base9 Low7 Intermediate9 High9 Interpretatie: CDC controles liggen onder CV% onder 10 %. 5. Validatie van de gekozen methode

31 31 Meetbereik (bovengrens) Werkwijze Reeks aanmaken met zeer hoge CK-concentraties, [CK] uitzetten op aantal counts Interpretatie: bovengrens ligt ongeveer op 8000 counts 5. Validatie van de gekozen methode

32 32 Lineariteit Werkwijze Gemeten concentraties CK uitzetten tov. aantal counts Interpretatie: Rechtlijnig verband tussen counts en concentratie CK in plasma. 5. Validatie van de gekozen methode

33 33 Stabiliteit Werkwijze Staal over 3 dagen gemeten en opgeslagen in verschillende temperaturen CV% Oven 4 Kamertemp. 2 Koelkast12 Diepvries 3 Interpretatie: CV % ligt bij de meeste onder 10 %. Beperkte tijdspanne -> goede resultaten. Interpretatie: Rechtlijnig verband tussen counts en concentratie CK. 5. Validatie van de gekozen methode

34 34 Besluit en discussie  Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne is pas te overwegen als een curatieve therapie bestaat.  Beste performantie met tweestapsreactie en fluorometrische aflezing.  Discussiepunten: -niet kwantitatief (pos. bias tov. CDC controles) (ideaal beschikbare externe standaarden) -verder op punt stelling van methode voor aanmaak standaarden (geen theoretische [CK], maar gemeten [CK] in plasma van standaard). 6. Besluit

35 35 HOWEST.be Thijs Decuyper Stageplaats: AZ Sint-Jan Brugge AV Dienst: Klinische scheikunde, afdeling neonatale screening Stagementor: Dr. D. Bernard ABO E. Verhoye Eindwerktitel:Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne Bedankt voor jullie aandacht! Vragen?


Download ppt "1 Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne OP PUNT STELLING EN VALIDATIE VAN EEN CREATINE KINASE BEPALING Thijs Decuyper O.l.v. Dr. D. Bernard en."

Verwante presentaties


Ads door Google