De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Methodenleer Ligand-receptor interactie: Ligand binding.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Methodenleer Ligand-receptor interactie: Ligand binding."— Transcript van de presentatie:

1 Methodenleer Ligand-receptor interactie: Ligand binding

2 Fig 4.1 Dosis-respons kurve voor de binding van een ligand aan een membraanreceptor De y-as geeft het % respons aan. pEC 50 is de negatieve logaritme van de Effectieve Concentratie nodig voor half- maximale respons

3 Lineweaver-Burk vergelijking Scatchard vergelijking Y= = (3) Fractionele saturatie Hill plot Log ( )= n log[L] –log K d

4 Fig 4.2 Scatchard plot voor binding aan twee verschillende bindingsplaatsen met respectievelijk hoge (A) en lage (B) affiniteit: a) Resultaat van niet-lineaire curve fitting van een 2-site model. Lijn C is een bifasische isoterm die de totale binding aan de twee plaatsen tegelijk beschrijft, en de K d en B max oplevert van de twee bindingsplaatsen. Lijn A en B beschrijven de lineaire bindingseigenschappen aan elk van de twee plaatsen apart. b) Bij benadering kan men ook met een eenvoudige lineaire regressie door het begin (hoge affiniteit) en het late (lage affiniteit) deel van de bifasische curve, een schatting maken van de K d en B max waarden van respectievelijk de hoge en de lage affiniteitsplaatsen.

5 Fig 4.3 Scatchard plot: (a): 1 type bindingsplaats en geen coöperativiteit (b): 2 types van bindingsplaatsen en geen coöperativiteit (c): 1 type bindingsplaats met positieve coöperativiteit (d): 1 type bindingsplaats met negatieve coöperativiteit r is het aantal mol ligand gebonden per mol receptor; [L] is de ligandconcentratie

6 Fig 4.4 Lineweaver-Burke plot Een plot van het omgekeerde van de gebonden ligandconcentratie tegen het omgekeerde van de vrije ligandconcentratie geeft een lineair verband. Uit de helling en het afgesneden stuk kan men de dissociatieconstante (K d ) en het totaal aantal receptorplaatsen per cel (R t ) afleiden. 1/[L] 1/[RL] 1/[R t ] -1/[K d ] K d /R t

7 Fig 4.5 Hill plot voor een coöperatieve binding; de helling (Hill coëfficiënt H) gaat naar 1 bij zeer lage en zeer hoge ligandconcentratie Y is de bezettingsgraad L is de ligandconcentratie Log L Log Y/(1-Y)

8 PreparaatToepassingen en kenmerken WeefselsnedesReceptor distributie; aantal receptoren per cel fluorescentiemicroscopie en autoradiografie Geïsoleerde cellenPost-translationele modificaties, insertie, downregulatie, koppeling aan cellulaire signalen. Recombinante receptoren geëxprimeerd in gecloonde cellijnen (VB COS-1, COS-7, 293- HEK) Zelfde mogelijkheden maar veel homogener NOTA: posttranslationele modificaties (vb glycosylatie) en aanwezigheid van andere componenten Membraan preparatenBiochemische karakterisering; Detergent- gesolubiliseerde receptorproteïnen Biochemisch karakterisering op moleculair niveau; Reconstitutie met fosfolipiden

9 Fig 4.6 Specifieke en niet-specifieke binding van een ligand aan een membraanreceptor

10 Fig 4.7 Schematische voorstelling van het principe van evenwichtsdialyse

11 Fig 4.8 A: (a) Refractie van licht bij overgang van een denser naar een minder dens medium (b) Totale interne reflectie onder een een invalshoek <  B: De “evanescent wave”: stippellijn is in afwezigheid van SPR; de volle lijn geeft aan hoe ver het versterkte golfveld bij SPR binnendringt in de meetoplossing aan de tegengestelde kant van het gereflecteerde licht. De sterkte neemt exponentieel af met de afstand van het oppervlak. AB

12 Fig 4.9 Schema voor Surface plasmon resonance (SPR): (a) De 4 lagen van de sensor-chip: de surface matrix is een dextraanlaag waaraan het targetmolecule gefixeerd wordt; De dextraanlaag is door de linker covalent gebonden aan de goudfilm. (b) De ligandoplossing interageert met de gefixeerde receptor in de flow kamer; De stijging van de ligandconcentratie in de oppervlaktelaag wordt gevolgd in de tijd als een verandering in de SPR respons; de detector bestaat uit licht-gevoelige diodes

13 Conclusie: voornaamste parameters uit bindingsstudies (1) de K d of dissociatieconstante (normale range M); (2) B max totaal aantal bindingsplaatsen = de concentratie aan receptormoleculen per cel (R t ) vermenigvuldigd met het aantal bindingsplaatsen per receptor (n) (3) de Hill coëfficiënt geeft een idee over de coöperativiteit in het geval van multipele bindingsplaatsen (4) De bezettingsgraad, [RL]/[R t ], is in principe evenredig met de respons. Meestal is de absolute receptorconcentratie niet bekend, maar kan men toch uit een meting van de respons en maximale respons, de bezettingsgraad en daaruit de K d afleiden.


Download ppt "Methodenleer Ligand-receptor interactie: Ligand binding."

Verwante presentaties


Ads door Google