De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven."— Transcript van de presentatie:

1 Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven

2 Inhoud 1.Polycythemia Rubra Vera 1.Symptomen 2.Diagnose 2.PRV-1 gen overexpressie: een nieuwe moleculaire marker voor Polycythemia Rubra Vera 1.PRV-1 gen en RQ-PCR 2.Critical Appraisel 1.Analytische performantiekarakteristieken 2.Diagnostische performantiekarakteristieken 3.Klinische impact 4.Organisatorische impact 5.Kostprijs 6.Decision making

3 1. Polycythemia Vera Rubra of Ziekte van Vacquez

4 Polycythemia Rubra Vera Myeloproliferatieve ziekte –Verworven mutatie van een hematopoëtische pluripotente stamcel  Afwijkingen in de drie mergreeksen –Klassiek onderscheidt men (FAB): 1.Polycythemia Rubra Vera 2.Essentiële trombocytose 3.Myelofibrose 4.Chronische myeloïde leukemie

5 Symptomen 6e – 7e levensdecade, Incidieus Hyperviscositeit: hoofdpijn, duizeligheid, visusstoornissen, neusbloedingen, diffuse pijnen in de ledematen en abdomen Tromboseneiging (perifeer + centraal) Jeuk Plethora Splenomegalie Bloedingen (GI)

6 Diagnose (1) Verhoogde rode bloedcel massa Absolute of relatieve erytrocytosis? HTC > 56% (♀) of 60% (♂): PV na uitsluiten secundaire oorzaken (PVSG) Hb > 16,5 g/dL (♀) of 18,5 g/dL (♂): major criterium (WHO) Heike L Pahl, Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(4), 2004

7 Diagnose (2) Primaire of secundaire polycytemie? Carboxyhemoglobine gehalte? UpToDate Online version 12.2 (2004)

8 Diagnose (3) EPO dosage –Relatief eenvoudig - CHU Sart Tilman Luik –Laag erytropoëtine gehalte: primaire erytrocytosis –Hoog erytropoëtine gehalte: secundaire erytrocytosis Beenmergkweek: –Autonoom in vitro laten groeien van endogene erytroïde koloniën (EEK’s) –Omslachtig, arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren, niet kosten- effectief Morfologisch onderzoek van het beenmerg: –Weinig zinvol, enkel in DD. andere myeloproliferatieve ziekten –Geen criterium voor diagnosestelling van PV

9 Diagnose (4) Histologisch onderzoek van beenmergbiopt: –Kan diagnose van PV bevestigen –↑ aantal grote megakaryocyten in clusters, proliferatie van de 3 mergreeksen met vooral proliferatie van de erytropoïese hyperplasie van gedilateerde sinussen Cytogenetische afwijkingen: –Slechts in 10 – 20% afwijkend –Bewijs klonale aandoening

10 Diagnose (5) Gemodifieerde PVSG-criteria volgens Berlin (2000) WHO. Tumors of the Hematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press, Lyon, France (2001)

11 Diagnose – nieuwe testen (6) Verminderde expressie van de TPO receptor (c-Mpl) in plaatjes en megakaryocyten [Moliterno et al]  Proliferatie van plaatjes in PV is onafhankelijk van TPO, cfr. RBC – epo Mbv. ELISA platelet-rich plasma (PRP) serotonine levels meten in pt met myeloproferatieve aandoeningen: lagere levels in patiënten met PV, ET en myeloïde metaplasie in vergelijking met secundaire polycytemie en controle patiënten Overexpressie van PRV-1 mRNA

12 2. PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”

13 2.1. PRV-1 gen en RQ-PCR

14 PRV-1 gen? PRV-1 mRNA overexpressie in de granulocyten van perifeer bloed bij PV i.t.t. SE, CML, AML In fysiologische toestand expressie in het beenmerg perifeer bloed, geen beenmerg! PRV-1 proteïne levels verschillen niet tussen PV en gezonde personen geen flowcytometrie, geen ELISA PRV-1 gen –Behoort tot de uPAR/Ly6/CD39 receptoren –Chromosoom 19 band region q –Overexpressie mogelijks door aberrante transcriptie, geen structurele wijziging van het gen –Rol in de pathofysiologie van PV?

15 Principe real-time PCR Oligo dT primer bindt mRNA RT maakt 1e streng cDNA aan RT heeft endo H aktiviteit Dubbelstrengs cDNA

16 Principe real-time PCR 1.Denaturatie = splitsen van ds cDNA (95°) 2.Annealing = binden van de primers (60°) 3.Extension = vormen van een complementaire cDNA-streng mbv Taq- polymerase (60°) QR Real-time PCR: fluorofoor gelabelde probe!

17 Probe bestaat uit 5’ reporter label en een 3’ quencher label Probe wordt afgebroken door de 5’ nuclease aktiviteit van het Taq- polymerase => fluorescentie ↑ Ontstaan van 2 nieuwe identieke ds cDNA ketens Opnieuw denaturatie, annealing, QR

18 R R Q QQ Q R R extension, denaturatie, annealing, …  Exponentiële vermenigvuldiging van de gewenste DNA- sequentie

19 Afbraak van de probe => R komt vrij => toename in fluorescentie, uitgedrukt in CT-waarde De CT-waarde (cycle treshold) is die cyclus waarbij een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie overschreden wordt Kwantitatieve bepaling: aan de hand van een IJKLIJN met standaard DNA en CT-waarden

20 Standaardcurve (1) Met behulp van een plasmide: –4018 Kbp lang –Bevat fragmenten van het PRV-1 gen en het house-keeping gen GAPDH (Dr. M.R. Veldwijk, German Cancer Research Center, Heidelberg) –Plasmide transformatie naar E. coli DH5α, dan amplificatie –Plasmideconcentratie meten in het lysaat –Lineariseren van het plasmide –Dn concentratie geknipt plasmide meten –M.b.v. MW : aantal kopieën plasmiden berekenen GUS (ß-glucuronidase) : commerciële kit

21 Standaardcurve (2) Seriële standaardreeks: –10 3 kopieën/5µL –10 4 kopieën/5µL –10 5 kopieën/5µL Na uitvoeren PCR: aantal kopieën t.o.v. CT-waarde  Standaardcurve voor GUS  Standaardcurve voor PRV-1 Elk staal (in triple): –Aantal kopieën PRV-1 –Aantal kopieën GUS => Ratio kopieën PRV-1/GUS

22 2.2. Appraisal

23 Clinical bottom line Kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA expressie met behulp van ‘real-time polymerase chain reaction’ is nuttig bij de diagnose van Polycythemia Rubra Vera of ziekte van Vacquez. De nieuwe parameter kan gebruikt worden bij patiënten met erytrocytosis, gestegen hematocriet en/of gestegen hemoglobine voor de differentiële diagnose tussen primaire en secundaire erytrocytosis.

24 1. Analytische performantiekarakteristieken 1.Pre-analytische variabelen Perifeer bloed, EDTA-staal Flebotomie, hydroxyurea en interferon-α hebben een invloed op PRV-1 overexpressie Bij pt met erytrocytosis moet een infectieus probleem uitgesloten worden alvorens PRV-1 expressie te gebruiken bij de diagnosestelling Staalstabiliteit: RNA extractie / aanmaken van cDNA gebeurt best binnen de 24u

25 2. Analytische parameters intra-assay variatie: –Elk staal wordt in triple uitgevoerd –Het gemiddelde van het aantal cDNA kopieën, corresponderend bij de respectievelijke CT waarden, wordt gebruikt voor de PRV-1/GUS ratio –Gemiddelde intra-CV (%CT) (n = 23): 0,83% 1,27% voor PRV-1 0,39% voor GUS

26 inter-assay variatie: –Bij elke run wordt er een standaardcurve gemaakt m.b.v. een plasmide –Voor 5 runs: CV’s van de CT’s voor 1000, en kopieën/5µL 1000/PRV/CT1000/GUS/CT10000/PRV/CT10000/GUS/CT100000/PRV/CT100000/GUS/CT ,62826,222,6 2 31,230,227,926,924,522, ,627,726,524, ,830,127,826,924,722,9 5 31,13027,626,824,723,1 mean 31,0229,927,826,6624,1422,84 SD 0,1480,2830,1580,3050,8850,230 CV 0,4780,9460,5691,1433,6711,008

27 Accuraatheid (bias): afhankelijk van accuraatheid van de standaarden. Het opstellen, synthetiseren, zuiveren en kalibraties van DNA standaarden is van belang Vergelijking met EPO dosage (n = 16): –Sensitiviteit PRV-1 100%, specificiteit PRV-1 100% –Groot aantal stalen met normaal EPO gehalte! –Prijs EPO: 17 € Prijs PRV-1 expressie: +/- 105 €

28 Lineariteit: correlatiecoëfficiënt Binnen de range van 1 tot : lineair verband tussen log cDNA en de CT waarden. Referentie range: –≥ 130: PVbevestigen! (TO DO) –< 130: geen PV Analytische range : Rekening gehouden met de amplificatie limiet (betrouwbaar vanaf 50 kopieën), is het analytische bereik 20 tot 40 CT’s. Turn around time (TAT): max. 1x/maand en min. 1x/2 maanden

29 Inschatting van het aantal te verwachten aanvragen –a.d.h.v. EPO dosage: 51 aanvragen in aanvragen in 2004 (jan-okt) –52 aanvragen verkregen, waarvan 9 uit de periferie (17%) Kwaliteitscontrole: doel = de reproduceerbaarheid van de PCR bevestigen. –IQC: Het plasmide met zijn verdunningen is een controle op de verschillende stappen van de PCR Bij elke PCR moet de efficiëntie hetzelfde zijn E=10(-1/slope)-1 –EQC: (nabije?) toekomst

30 2. Diagnostische performantiekarakteristieken Introduction Doel: DD. PV en sec. erytrocytosis m.b.v. RQ-PCR. Methods Participants PB van pt verdacht voor PV (symptomen) PB van pt gekend met PV (reeds R/) PB van 9 gezonde donoren PB van 5 stamceldonoren onder groeifactoren retrospectieve studie! Test Methods gouden standaard: WHO classificatie RQ-PCR: – Isolatie WBC (Ficoll-Hypaque densiteit centrifugatie) – Lysis RBC (NH 4 CL) – RNA-extractie (Qiagen RNeasy Mini Kit) – Aanmaken van cDNA (EAC-protocol) – Primer/probe sequenties (Julian Topaly, IG, Universiteit van Heidelberg) – PRV-1 plasmide (Dr. Veldwijk, German Cancer Reserarch Center, Heidelberg) M. Bossuyt, “Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: The STARD initiative.” Clin. Chemistry 2003;49:1,1-6

31 – PCR: 25 µl reactie bevat 12,5 µl Taqman Universal Master Mix 2x (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 4,5 µl RNAse vrij water, 300 nM forward en reverse primers (Eurogentec, Belgium), 200 nM TaqMan probes (Eurogentec), en 5 µl cDNA van het plasmide. Elke analyse in triple op de ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) Negatieve controles (RNAse vrij water) De kwaliteit van het RNA en de efficiëntie van de cDNA synthese wordt gecontroleerd door de amplificatie van GUS Kwantificatie PRV-1 en GUS: standaardcurven plasmiden Uitvoering: ervaren MLT’s o.l.v. F. Houtmeyers Stabilisatie van het RNA diepvries tot +/- 8 stalen verzameld Rapportering: ratio = # kopieën PRV-1/ # kopieën GUS Aanvankelijke cut-off: 100 Results Participants van ‘03 tot eind ‘04 / Gem. lft studiepopulatie 61 jaar (34 ♂, 17 ♀) Twee groepen: – groep pt die nog geen behandeling had gekregen (n = 42) – groep PV pt die reeds therapie gekregen hadden (n = 9) UZ Leuven (n = 42), Aalst (n = 7), Dendermonde (n = 2)

32 Test results gezonde donoren: range 2,64- 39,4; mean 8,9 Stamceldonoren onder GF: range 77,6 – 230,4; mean 139,5 PV, reeds R/: range 6,2 – 1147; mean 271 PV, niet R/: range 140,1 – 1372; mean 681,8 Sec. erytrocytosis: range 0,4 – 129,2; mean 34,8 Invloed van therapie! Bij exclusie groep reeds R/: cut-off 130 Estimates Sensitiviteit: 100% Specificiteit:100% LR+ve= oneindig LR-ve = 0 NND = 1 Reproduceerbaarheid: intra-assay 0,83% inter-assay 1,3% Discussion 1.Hoewel kleine studiepopulatie: kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA heeft een waarde bij de diagnosestelling van pt met erytrocytosis. 2.Cut-off 130 bevestigen (TO DO)

33 disease no disease 1 0, ,95 4 7,4 5 7,5 6 7,8 7 7, , , , , , , , , , , , , , , , , , disease no disease PVNiet-PV

34 3. Klinische impact Diagnostisch aspect: nut bij diagnose PV (DD. prim/sec erytrocytosis) Evt. EPO dosage en/of EEK’s vervangen Cytologie levert geen meerwaarde op in de diagnostiek van PV (tenzij DD. myeloproliferatieve ziekte) Botboorbiopsies: richtinggevend cytogenetica: minderheid + Behandeling: interferon: down-regulatie van PRV-1 expressie PRV-1 expressie: merker voor klinische respons? Health outcome: juiste diagnosestelling! In de literatuur (nog) geen evidentie dat PRV-1 gen bepaling de outcome verbetert Prognose en follow-up: /

35 4. Organisatorische impact Impact in het ziekenhuis: –Beenmergcytologie is geen criterium. Morfologisch onderzoek vergt +/- 1 uur werk voor MLT/GSO-ASO/supervisor –Beenmergkweek is tijdrovend en kostelijk. Momenteel wordt het enkel uitgevoerd bij twijfel over de diagnose ( ) –Er is geen verkorting hospitalisatieduur (meestal ambulante setting) Is PRV-1 geïncorporeerd in klinische richtlijnen of guidelines? H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4) –‘European Leukemia Network’ zal binnen enkele maanden guidelines publiceren voor de standaardisatie van het RQ-PCR assay –Voorstel PVSG criteria verder aan te passen

36 Diagnose PV: A1 + A2 + A3 of A4 A1 + A2 + twee B’s H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4)

37 5. Kostprijs: binnen en buiten het labo Actuale kost Rekening houdend met de reagenskost, distributiekosten, primaire en secundaire activiteiten: 105 € per patiëntenstaal in batch van 10 stalen Terugbetaling CMD’s ontvangen een ‘enveloppe’, geen RIZIV tussenkomst Voordeel elders in het ziekenhuis 1.PRV-1 kan EPO dosage vervangen 2.PRV-1 expressie + EPO dosage kan beenmergkweek vervangen (moeilijke standaardisatie, arbeidsintensief, niet kosten-effectief) 3.RBC-massa bepaling is niet steeds nodig (volgens clinici routinematig aangevraagd) – HTC > 56% (♀), HTC > 60% ( ♂) => PV (PVSG) – Hb > 16,5 g/dL (♀), Hb > 18,5 g/dL ( ♂) : major criteria volgens WHO

38 6. Decision making Impact van PRV-1 op het klinisch beslissing proces –VOORSTEL DIAGNOSEREGEL: Klinische vermoeden van PV Uitsluiten ET ! HTC > 52 % ( ♂), HTC > 48 % ( ♀) (uptodate) HTC > 50% ( ♂), HTC > 48% (♀) (http://intranet/patientenzorg/procedures.protocols.html)http://intranet/patientenzorg/procedures.protocols.html –Beenmergmorfologie is een overbodig onderzoek –RBC massa bepaling is niet steeds nodig Past de test binnen het eigen labo profiel? –De test staat volledig op punt. De PCR is gelijkaardig aan andere real- time PCR’s: minimum aan opleiding MLT –Lage frequentie test: uitvoeren indien er tijd is –Stalen opsturen naar ander labo: verlies kwaliteit (cfr. Stabiliteit!) Besluit: flowchart

39 Vermoeden PV Trombocytosis (> 400 x 10 9 /l) WBC (> 12 x 10 9 /l) Splenomegalie (klinisch/echo) Gestegen hematocriet / hemoglobine zuurstofsaturatie: gedaald carboxyhemoglobinegehalte verhoogd: rookstop 3-4m PRV-1 expressie botbiopsie cytogenetica (EPO) (beenmergkweek) WHO STAP 1 STAP 2 DD Absolute of relatieve erytrocytose? HTC > 56% vrouw HTC > 60% man Hb > 16,5 g/dl vrouw Hb > 18,5 g/dl man WHO *PVSG STAP 3 Ja: stap 3Neen: RBC-massa bepalen Absolute erytrocytose: secundaire of primaire erytrocytose? Relatieve erytrocytose: diurectica, dehydratatie, vochtsequestratie * Dit criterium is minder streng aangezien 18,5 g/dl en 16,5g/dl ongeveer overeenkomt met een hematocriet van 54 en 48

40 TO DO / ACTIONS Reëvalutie cut-off Opstellen van een werkvoorschrift indien de test in de routine komt Aanvragers uit periferie verwittigen voor staalstabiliteit

41 Dank u voor uw aandacht! Speciale dank aan: Dr. N. Boeckx Dr. J. Frans Frans Houtmeyers Prof. F. Van Stapel


Download ppt "Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven."

Verwante presentaties


Ads door Google