Presentatie titel Microscopie Campbell H6.1 Reed H28, 29

Presentatie over: "Presentatie titel Microscopie Campbell H6.1 Reed H28, 29"— Transcript van de presentatie:

1 Presentatie titel Microscopie Campbell H6.1 Reed H28, 29
Rotterdam, 00 januari 2007 Rotterdam, augustus 2013, Gebaseerd op Campbell et al (2011) Biology, 9th edition, Pearson

2 Opbouw van de les Waarom microscopie?
Bouw van een helderveld lichtmicroscoop Wat zijn resolutie, contrast en scherptediepte? Contrastversterking door kleuring (algemeen/differentieel), fasecontrast , donkerveld Resolutie en numeriek apertuur Resolutievergroting door kleinere afstand preparaat-objectief, immersieolie, electronenmicroscopie (TEM) 3D door confocale microscopie en SEM

3 De noodzaak van een microscoop

4 Opbouw van de les Bouw van een helderveld lichtmicroscoop

5 Lichtmicroscoop HLO BML Robert Hooke (1667)
Antonie van Leeuwenhoek (1674) HLO BML

6 Lichtmicroscoop HLO BML
Resultaten met een replica (TU Eindhoven, groep Prof. Kroesen) : keukenzout kristallen HLO BML

7 Lichtmicroscoop HLO BML
Resultaten met een replica (TU Eindhoven, groep Prof. Kroesen) : doorsnede zonnebloemwortel HLO BML

8 Opbouw van een microscoop

9 Doorvallend licht: helderveld

10 Nat preparaat E.coli Weinig Contrast Weinig Resolutie HLO BML

11 Opbouw van de les Wat zijn resolutie, contrast en scherptediepte?

12 Wat is contrast? Hoog contrast, weinig licht passeert het object
Laag contrast, veel licht passeert het object HLO BML

13 Resolutie: de mate waarin twee losse punten nog afzonderlijk kunnen worden waargenomen (= oplossend vermogen)

14 scherptediepte http://www.pietel.be

15 Effect door scherptediepte
achter midden voor Medlibrary.org/medwiki/focus_stacking

16 Opbouw van de les Contrastversterking door kleuring (algemeen/differentieel), fasecontrast , donkerveld

17 Contrast versterking in lichtmicroscopie
Kleuringen in combinatie met eenvoudige lichtmicroscoop Algemeen (methyleen blauw) Specifiek: organellen (flagel, endosporen) Specifiek: differentieel (gram, zuurvast) Toegepast bij bacterie-, en schimmel-preparaten Fasecontrast microscoop Toegepast bij alle cellen Donkerveld microscoop Toegepast bij kleine bacteriën (mycoplasma) en dunne bacteriën (spirocheten/spirillen) Diafragma bij doorvallend licht iets dichtdraaien (tot 80% van de NA) HLO BML

18 Algemeen: Methyleen blauw
HLO BML

19 Differentieel: Gram kleuring
Lugol

20 Fasecontrast Faseverschillen worden gemanipuleerd tot intensiteit verschillen HLO BML

21 Fasecontrast/helderveld
licht fasecontrast Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) HLO BML

22 Donkerveld Er wordt niet gekeken naar doorvallend licht maar naar gereflecteerd licht Dit wordt vooral toegepast bij zeer kleine/dunne bacterien, met name spirillen en spirocheten HLO BML

23 Borrelia burgdorferi (ziekte van Lyme)
Donkerveld Borrelia burgdorferi (ziekte van Lyme) HLO BML

24 Fasecontrast/donkerveld
licht fasecontrast donkerveld Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) HLO BML

25 Opbouw van de les Resolutie en numeriek apertuur

26 Numerieke apertuur N = de brekingsindex v/h medium om de lens (1,0 voor lucht, 1,33 voor water, 1,56 voor olie) Θ = de grootste invalshoek ten opzichte van de normaal (loodrechte door het lensoppervlak) Hoe groter de numeriek apertuur (NA of An)(formule niet onthouden)... hoe groter de hoek van de lichtstralen die nog worden opgevangen door het objectief... hoe meer lichtstralen worden gebruikt voor het maken van een beeld... hoe scherper het beeld (resolutie) !

27 Opbouw van de les Resolutievergroting door kleinere afstand preparaat-objectief, immersieolie, electronenmicroscopie (TEM)

28 Resolutie versterking in lichtmicroscopie
Immersie-olie verhoogt brekingsindex Kwaliteit/breedte vd lens vergroot lichtopbrengst Sterke lens geeft brandpuntafstand dichterbij de lens, dus vergroot lichtopbrengst HLO BML

29 Grotere vergroting op zich geeft geen hogere resolutie

30

31

32

33

34 Hogere numerieke apertuur (hier: kleinere afstand lens-object) geeft wèl hogere resolutie

35

36 Welke foto heeft een hogere resolutie?

37

38

39 Resolutie en golflengte/deeltjesgrootte: electronenbundel geeft hogere resolutie dan licht

40

41 Opbouw van een electronen microscoop

42 Lichtmicroscopie / Elektronemicroscopie

43 Opbouw van de les 3D door confocale microscopie en SEM

44 Opbouw van een scanning electronen microscoop

45

46 Figure Examples of images of a similar specimen (the stomatal complex of Commelina communis) obtained using different microscopic techniques: (a) light microscopy (surface view); (b) transmission electron microscopy (transverse section through guard cell pair at mid pore); and (c) scanning electron microscopy (surface view). As an indication of scale, the width of a single guard cell is about 10 mm

47 Verschillende microscopietechnieken vereisen een andere fixatie / ‘kleuring’