H05IDB Marcel Lombaerts G3.052.

Presentatie over: "H05IDB Marcel Lombaerts G3.052."— Transcript van de presentatie:

1 H05IDB Marcel Lombaerts G3.052

2 IDB HC 9-12: Detectie en isolatie van nucleïne zuren
Principles and Techniques of......(Wilson and Walker) 7th edition H5.1, 5.2, 5.6 t/m 5.7.2, 5.8 en 5.10 t/m H10.2.1, en Biology (Campbell), 9th edition H16.1 en H20.1 en 20.2 Biochemistry (Campbell and Farrel), 7th edition H13.1, 13.2, 13.6 en 13.7

3 IDB HC 9-10: basis (+) nucleïnezuren
Structuur van DNA and RNA DNA sequenties bij NCBI Zuiveren van DNA, RNA and mRNA Restrictie enzymen Gel electrophoresis

4 I. Structuur van nucleotiden
DNA en RNA zijn polymeren. Bouwstenen zijn nucleotiden.

5 Suikers 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

6 U U Stikstofbasen 1 2 3 4 5

7 5’ en 3’ 5 3 5 3 RNA! H2O Wat zie je hier DNA/RNA?
Fosfaat is bij neutrale pH negatief geladen. Wat gebeurt er in een zure omgeving 3 5 H2O 3 RNA!

8 U Ketens 1 2 3 4 5

9 Baseparing G C C G C G A T T A Antiparalel
AT=2 H-bruggen; GC=3 H-bruggen Suiker fosfaat backbone A T

10 Baseparing G C A T

11 Opdracht A omdat hier veel GC bp zitten

12 RNA is een polymeer van rNTPs

13 RNA is instabieler dan DNA
RNA heeft OH groepen aan de C2 (2’), deze maken het molecuul gevoeliger voor hydrolyse DNA heeft geen 2'-OH is is daardoor stabieler Dat is logisch... Erfelijk materiaal moet ook stabieler zijn: gaat langer mee, RNA wordt gemaakt, vertaald en dan moet het afgebroken worden omdat ze anders vertaald blijven worden naar eiwitten 19

14 Verschillende typen RNA moleculen
Messenger RNA (mRNA) mRNA bevat de code van de te maken eiwitten Complementair aan de coderende DNA sequentie Ribosomal RNA (rRNA) Vormen de ribosomen (samen met enkele eiwitten) 3 typen in prokaryoten (5S, 16S, 23S) 4 typen in eukaryoten (5S, 5.8S, 18S, 25-28S) Transfer RNA (tRNA) Transporteerd aminozuren naar de plek van eiwitsynthese (small RNA: snRNA, snoRNA, miRNA, siRNA, piRNA) Sno= small nucleolar Pi= piwi: piwi RNA forms protein complexes and linked to gene silencing tRNA

15 RNA Er zijn verschillende RNA’s mRNA: worden vertaald naar eiwitten
rRNA: vormen de ribosomen die nodig zijn voor translatie tRNA: nodig voor het maken van eiwitten (gekoppeld aan aminozuren)

16 Voorbeeld tRNA RNA’s kunnen een intramoleculaire baseparing hebben (voornamelijk tRNA en rRNA)

17  Voorbeeld 16S rRNA

18 Lokatie in de cel • DNA: constante factor (“genetic makeup”) • RNA:
verschillen per celtype, fase, omgeving enz. (“information flow”)

19 Verschillen tussen RNA en DNA
• 2’ OH group (ribose) • Uracil binds Adenine (A,U,C,G) • Multiple types and roles • Often permanently modified via splicing • Usually single-stranded • Intramolecular binding DNA: • 2’ H (deoxyribose) • Thymine binds Adenine (A,T,C,G) • One biological form • Permanently modifications are rare (mutation) • Double stranded • Double helix structure

20 II. DNA sequenties: NCBI site
Coxiella burnettii (Q koorts) Serum: serologie (antilichamen) Bloed:PCR Overdracht via teken? Van schaap/geit op mens (zoonose) Uitleg: intronen/exonen DNA, coderende deel,

21

22 NCBI site

23 III. Isolatie en zuivering van nucleïnezuren
Welk nucleïnezuur heb je nodig? (ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA) Welk organisme? (menselijke cellen, lagere eukaryoten, planten, prokaryoten, virussen, enz.) Uitgangs materiaal? (heel orgaan, cel culture, bloed enz.) Wat ga je ermee doen? (PCR, cloneren, labellen, RT-PCR, cDNA synthesis, enz.)

24 Methode (algemeen) isolatie nucleïnezuren
Cellen openbreken Nucleïnezuren scheiden van de rest (eiwitten en membranen) Nucleïnezuren isoleren

25 DNA isolatie fenol chloroform (1)
Homogeniseren weefsel, lysis, proteinase K Eerst fenol en daarna fenol : chloroform : isoamylalcohol (25:24:1) Centrifugatie 2 epjes:

26 DNA isolatie fenol chloroform (2)
Precipitatie (neerslaan) - isopropanol, (soms KAc en) ethanol (eindconcentratie 70%) of ammoniumacetaat - incuberen: -20 °C tot 4 oC Afdraaien Wassen met ethanol 70-75% bij KT/ 4 oC

27 DNA isolatie fenol chloroform (3)
Drogen - “aan de lucht” - bij 37, 50, 60 oC “speedvac” DNA oplossen in 10 mM Tris 1mM EDTA (T10E1) pH 7,4 - 7,6 Oplossen RNA in RNase vrij H2O (soms TE) DNA bewaren bij 4C, RNA bij -80 of -20

28 Waarom? Cellen wassen? Wat zit er in lysisbuffer? ProtK stap? Fenol?
Wassen met 70% EtOH? Waarom drogen? TRIS in de buffer? EDTA in DNA buffers? Vaak geen EDTA in RNA oplosbuffers? Om medium te verwijderen (vaak negatieve effecten); EDTA TRIS Zeep (SDS); Afreken eiwitten (bv bij DNA isolatie uit weefsels: cellen laten los); kapotmaken en precipiteren eiwitten; Dan lost het in de pellet aanwezige zout op in de 30% water, DNA lost hier niet in op; Drogen: EtOH weg; TRIS: pH; EDTA wegvangen 2+ ionen (voor bv DNAses); RNases hebben geen 2+ionen nodig

29 Andere methoden… fenol/chloroform extractie en ethanol precipitatie
silica membraan kolommen anion exchange resins (ionenwisselaars) magnetische beads

30 DNA isolatie: silica membraan
- Homogeniseren (lyseren, met zout) - Centrifugeren Elueren (laag zout) Roche, Fermentas Met zout binding van het DNA. Zonder zout, met H2O-> elutie

31 Opdracht Een analist gebruikt de silica membraan methode voor het
isoleren van DNA uit cellen. Na het lyseren en het verwijderen van het celdebris brengt hij het sample met veel opgelost zout op de silica kolom. Vervolgens draait hij af en verwijdert de flow-thru. Hierna wast hij de kolom met water (flow-thru wordt weer verwijderd) waarna het DNA geëlueerd wordt met een laag zout buffer. Na meting op de NanoDrop blijkt dat er geen DNA aanwezig is in het sample. Leg uit wat de oorzaak hiervan is. Wassen met water haalt al het DNA van de kolom

32 Anion-exchange resin Homogeniseren lyseren, zonder zout Centrifugeren
Elueren (pH en zout concentratie) Qiagen kits

33 Elutie anionen wisselaar kolom

34 Opdracht Max recovery 95%. Dus 4 x 0,95= 3,8 µg
Max recovery 95%. Dus 4 x 0,95= 3,8 µg 3,8µg in 50µl=0,076 µg/µl = 76 ng/ µl

35 Magnetic particles/beads
- Homogeniseren met balletjes (silica coated) Magnetiseren Wassen - Elueren (losmaken van de balletjes) EZ1 Biorobot, Qiagen Magnapure, Roche Kingfisher Cobas Ampliprep binding: high salt Elution: low salt Ready-to-use eluate

36 Overzicht Qiagen site

37

38 RNA isolatie Erg vergelijkbaar met DNA isolatie (phenol chloroform procedure) In de cel zit veel meer RNA dan DNA RNA isolatie: meestal totaal RNA (rRNA, mRNA, en in mindere mate tRNA) mRNA (poly A+ RNA) ≈ 1-5% van het totale RNA

39 mRNA isolatie 1-5% van het totaal RNA in eukaryoten is mRNA
het merendeel is rRNA TTTTTTT Oligo (dT)25 bead Poly (dT) bead genexpressie onderzoek

40 Werken met RNA RNase!!!! Bewaar RNA bij (-20°C of) -80°C, werk op ijs
Draag handschoenen Gebruik DEPC-treated water om oplossingen te maken Voeg eventueel RNase inhibitors toe Gebruik RNase vrije epjes en puntjes Andere materialen: hitte (180 ºC gedurende enkele uren), wassen met DEPC water, NaOH of H2O2 Maak een aparte RNA ruimte? RNA lab 40

41 DNA / RNA hoeveelheid & kwaliteit
41

42 DNA / RNA concentratie bepalen
[DNA] of [RNA]: absorptie of emissie (fluorescentie) Absorptie x nm Licht (x nm golflengte) Emissie  fluorescentie y nm excitatie Licht (x nm golflengte) 42

43 DNA / RNA concentratie bepalen (absorptie)
I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie) Absorptie x nm Licht (x nm golflengte) 43

44 DNA / RNA concentratie bepalen (absorptie)
I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie) 1) Meet de A260 nm (OD260) A260=1 dan 50 g/ml DNA of 40 g/ml RNA concentratie DNA in g / ml = 50 * absorptie DNA bij 260 nm concentratie RNA in g / ml = 40 * absorptie RNA bij 260 nm 2) Meet bij 280 nm = eiwitten Bepaal de 260 / 280 ratio: DNA: A260/280=1,8 RNA: A260/280=2,0 (pH7,5) In de praktijk: tussen 1.6 en 2.0 liggen – (redelijk) eiwitvrij DNA / RNA Let op soms ook OD ipv A 44

45 Opdracht 5 l van een DNA oplossing wordt doorgemeten in een eindvolume van 1 ml, de OD260 = 0,213. Cuvetlengte is 1 cm Wat is de concentratie van deze DNA oplossing? OD = 1=50 g/ml, DNA is verdund gemeten en wel 1000/5 =200x OD = 0,213 = 0,213 x 50 g/ml x200 = 2130 g/ml , dat is ook 2,13 g/l

46 DNA / RNA concentratie Nanodrop UV-VIS spectrofotometer
Rekent zelf de concentratie en A260/280 verhouding uit 46

47 DNA / RNA concentratie bepalen (fluorescentie)
II. Concentratie DNA & RNA d.m.v. fluorescentie Emissie  fluorescentie y nm excitatie Licht (x nm golflengte) 47

48 DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen Picogreen toevoegen aan dsDNA  fluorescentie 48

49 DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen 1 Maak een ijklijn 2 Sample waarvan je de concentratie wilt weten 375 ng / ml 49

50 DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen 50

51 DNA / RNA concentratie Fluorescentie (Picogreen) vs UV-VIS
Picogreen UV-VIS meet dsDNA meet dsDNA, nucleotiden, RNA geen contaminanten interferentie door contaminanten sensitief minder sensitief (A260 van 0.1 = 5 ug/ ml DNA) 51

52 DNA / RNA kwaliteit Agilent Bioanalyzer Gel electroforese 52
biotrek.rdrake.org/img/gallery/33electrophore 52

53 DNA / RNA kwaliteit DNA kwaliteit
Isoleren: voorzichtig omdat grote DNA moleculen eenvoudig kunnen breken 53

54 DNA / RNA kwaliteit RNA kwaliteit (RNA Interety Number) RIN waarde
1 : 2 2:1 54

55 IV. Restrictie enzymen (H5.6 Wilson & Walker 7th)
Enzymen die DNA aan specifieke sequenties (meestal palindromen) kunnen binden en de suiker-fosfaatketen kunnen verbreken (endo-nuclease) Betrokken bij afbraak “vreemd DNA” Vele geïdentificeerd (500+) Best bekend: type II restrictie enzymen Vele zijn commercieel verkrijgbaar Cleaves DNA backbone of each strand by catalyzing hydrolysis of phosphodiester bonds and produces a cut.

56 Restrictie enzymen (H5.6 Wilson & Walker 7th)
Voorbeeld: EcoRI: herkent een 6 base-pair palindromische sequentie 5’---GAATTC---3’ 3’---CTTAAG---5’ 5’---G AATTC---3’ 3’---CTTAA G---5’ ---GAATTC--- Cleaves DNA backbone of each strand by catalyzing hydrolysis of phosphodiester bonds and produces a cut. EcoRI:

57 Restrictie enzymen (H5.6 Wilson & Walker 7th)

58 Restrictie enzymen (H5.6 Wilson & Walker 7th)
Blunt Sticky

59 Roche: SuRE/Cut buffers
If desired, more than one enzyme can be included in the digest if both enzymes are active in the same buffer and the same incubation temperature.

60 V. Agarose gel electroforese
Gel running Agarose gel scheid DNA fragments o.b.v. grootte Kleine fragmenten gaan sneller door de gel Buffer: bv TBE of TAE

61 DNA gel electrophorese
Moleculair weight markers = DNA fragmenten met bekende grootte Loading buffer EtBr/Sybr Safe 0.4-2% agarose gel Gel buffer/running buffer

62 Agarose gel electrophorese
DNA “kleuren”: EtBr Let op: is carcinogeen! SyBr Safe Saunders College Publishing

63 DNA Gel Electrophoresis

64 Zijn de volgende opmerkingen juist of onjuist?
Een hoog percentage agarose gel (2%) is geschikt om twee PCR fragmenten van 7000 bp en 7500 bp van elkaar te scheiden De pH van de buffer heeft invloed op de migratie van DNA door de gel Je zou i.p.v. TBE buffer ook 0,9% NaCl kunnen gebruiken voor de electroforese DNA migreert in een agarose-gel van de kathode (-) naar de anode (+) Nee max 1% Ja: zure omgeving: DNA niet geladen, loopt niet door de gel Dit is niet wenselijk (maar misschien werkt het wel), NaCl is geen bufffer, door electrolyse zal aan de kathode H2 en OH- ontstaan, aan de anode zal H+ en O2 ontstaan; dus pH verschillen omdat NaCl niet buffert ja

65