Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven

Presentatie over: "Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven"— Transcript van de presentatie:

1 Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven 14-12-2004
Critically Appraised Topic: PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” Goedemiddag allemaal. Ik mag u vandaag mijn kritische testevaluatie voorstellen. Het onderwerp is PRV-1 gen : een nieuwe moleculaire merker voor polycythemia rubra vera. Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven

2 Inhoud Polycythemia Rubra Vera
Symptomen Diagnose PRV-1 gen overexpressie: een nieuwe moleculaire marker voor Polycythemia Rubra Vera PRV-1 gen en RQ-PCR Critical Appraisel Analytische performantiekarakteristieken Diagnostische performantiekarakteristieken Klinische impact Organisatorische impact Kostprijs Decision making Vooreerst zou ik graag iets vertellen over de ziekte zelf: de symptomen en de huidige diagnostiek van PV. In deel twee komt PRV-1 gen overexpressie aan bod als nieuwe merker voor PV. Ik ga iets zeggen over het PRV-1 gen zelf , kwantitatieve real-time PCR en dan ga ik onze voorlopige resultaten overlopen.

3 1. Polycythemia Vera Rubra of Ziekte van Vacquez
Polycythemia vera rubra of de ziekte van vacquez

4 Polycythemia Rubra Vera
Myeloproliferatieve ziekte Verworven mutatie van een hematopoëtische pluripotente stamcel Afwijkingen in de drie mergreeksen Klassiek onderscheidt men (FAB): Polycythemia Rubra Vera Essentiële trombocytose Myelofibrose Chronische myeloïde leukemie PV behoort tot de myeloproliferatieve ziekten. Deze ontstaan door een beschadiging van de pluripotene stamcellen wat leidt tot afwijkingen in de drie mergreeksen.Bij PV staat de hyperplasie van de rode reeks op de voorgrond. Klassiek onderscheidt men volgens de FAP classificatie PV, ET, MF en CML. Het is belangrijk om te weten dat er overlappingssyndromen bestaan, dat alle myeloproliferatieve aandoeningen in elkaar kunnen overgaan en dat sommige chronische myeloproliferatieve ziekten eindigen in een akute leukemisch fase.

5 Symptomen 6e – 7e levensdecade, Incidieus
Hyperviscositeit: hoofdpijn, duizeligheid, visusstoornissen, neusbloedingen, diffuse pijnen in de ledematen en abdomen Tromboseneiging (perifeer + centraal) Jeuk Plethora Splenomegalie Bloedingen (GI) De ziekte van Vacquez is een typische aandoening van de oudere man en begint meestal erg incidieus. De hyperviscositeit en de rode verkleuring aangezicht staan dan op de voorgrond. De hyperviscositeit leidt typisch tot hoofdpijn, duizeligheid, .. Dikwijks bestaat er een verhoogde tromboseneiging met zowel perifere als centrale (CVA) lokalisatie. Een typisch symptoom is jeuk Een paradoxaal verschijnsel is dat er vaak verhoogde bloedingsneiging waargenomen wordt. vb hoge GI bloedingen.

6 Verhoogde rode bloedcel massa
Diagnose (1) Verhoogde rode bloedcel massa Absolute of relatieve erytrocytosis? HTC > 56% (♀) of 60% (♂): PV na uitsluiten secundaire oorzaken (PVSG) Hb > 16,5 g/dL (♀) of 18,5 g/dL (♂): major criterium (WHO) Verhoogde rode bloedcel massa is het meest vooraanstaande kenmerk in de diagnostiek van PV. Een gestegen hb of HTC zijn suggestief voor de aanwezigheid van polycytemie. Maar, wordt deze stijging veroorzaakt door een stijging van de rbc of door een vermindering van het plasmavolume (vb. inname van diuretica?). Met RBC massa kunnen we dit onderscheid maken, dit onderzoek wordt uitgevoerd op nucleaire geneeskunde. Dit wil niet zeggen dat rode bloedcel massa, wat een dure procedure is, bij elk vermoeden van PV uitgevoerd moet worden. Wanneer de htc hoger is dan... kan PV bijna meet zekerheid gesteld worden na uitsluiten van sec oorzaken (PVSG). Indien bij vrouwen het hb hoger is dan 16,5 en bij mannen hoger dan 18,5 dan is dit volgens de WHO een major criteria en hoeft de RBC-massa niet meer bepaald te worden. Heike L Pahl, Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(4), 2004

7 Diagnose (2) Primaire of secundaire polycytemie?
Eens een verhoogde RBC-massa met zekerheid is vastgesteld, dient te worden opgezocht of het een 'secundaire' of een 'primaire' vorm betreft. Voorbeelden van secundaire polycythemie zijn leven of grote hoogte, COPD patiënten. Roken is een frequente oorzaak van een wisselend verhoogde hematocriet. Soms is een meting van de arteriële zuurstofsaturatie of bepaling van het carboxyhemoglobine aangewezen ter uitsluiting van een aantal evidente zaken. Carboxyhemoglobine gehalte? UpToDate Online version 12.2 (2004)

8 Diagnose (3) EPO dosage Beenmergkweek:
Relatief eenvoudig - CHU Sart Tilman Luik Laag erytropoëtine gehalte: primaire erytrocytosis Hoog erytropoëtine gehalte: secundaire erytrocytosis Beenmergkweek: Autonoom in vitro laten groeien van endogene erytroïde koloniën (EEK’s) Omslachtig, arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren, niet kosten-effectief Morfologisch onderzoek van het beenmerg: Weinig zinvol, enkel in DD. andere myeloproliferatieve ziekten Geen criterium voor diagnosestelling van PV Het serum erytropoïetine gehalte bepalen is relatief eenvoudig te bepalen. Laag epo duidt op primaire erytrocytosis en hoog epo op SE. We voeren deze test niet zelf uit, maar sturen hem door naar Luik. Een andere nieuwe techniek is het autonoom (zonder toevoegen van EPO) laten groeien van endogene erytroide kolonies. Ze is gebaseerd op de vaststelling dat de abnormale erytroide voorlopers van PV meer gevoelig zijn voor EPO en in cultuur koloniën vormen zonder toevoegen van epo. De test is erg omslachtig, arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren en niet kosten-effectief. Morfologisch onderzoek van het beenmerg is weinig zinvol, en enkel nuttig in de DD met andere MPD. Dit is geen criterium voor diagnosestelling van PV.

9 Diagnose (4) Histologisch onderzoek van beenmergbiopt:
Kan diagnose van PV bevestigen ↑ aantal grote megakaryocyten in clusters, proliferatie van de 3 mergreeksen met vooral proliferatie van de erytropoïese hyperplasie van gedilateerde sinussen Cytogenetische afwijkingen: Slechts in 10 – 20% afwijkend Bewijs klonale aandoening Histologie onderzoek is volgens sommige auteurs een belangrijk onderzoek om PV te bevestigen. Gestegen aantal grote megakaryocyten in clusters, proliferatie van de 3 mergreeksen met voornamelijk proliferatie van de erytropoiese en hyperplasie van gedilateerde sinussen zijn diagnostisch kenmerken in de beenmerghistologie. Cytogenetica is slechts afwijkend in > 10% vd gevallen en is een bewijs voor een klonale aandoening.

10 Gemodifieerde PVSG-criteria volgens Berlin (2000)
Diagnose (5) De polycythemia vera study groep heeft een aantal criteria opgesteld voor de diagnose van PV. Dit is de meest recente versie van 2000. In 2001 heeft ook de WHO criteria opgesteld. Voor de diagnose van PV zijn A1 en A2 criteria altijd nodig, dit zijn de gestegen rode bloedcelmassa en de afwezigheid van secundaire erytropoiese. Dit moet aangevuld worden met een ander kriterium uit A om tot de diagnose van PV te komen: splenomegalie, abnormaal karyotype of bij de WHO beenmergkweek. Een andere mogelijkheid voor de diagnose is A1 plus A2 en twee kriteria uit de B’s: trombocytosis, leucocytosis, splenomegalie, beenmergkweek of gedaald epo voor de PVSG, voor de WHO is dit trombocytosis, leucocytosis, laag epo of beenmerghistologie (wat niet bij de PVSG beschreven wordt). Gemodifieerde PVSG-criteria volgens Berlin (2000) WHO. Tumors of the Hematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press, Lyon, France (2001)

11 Diagnose – nieuwe testen (6)
Verminderde expressie van de TPO receptor (c-Mpl) in plaatjes en megakaryocyten [Moliterno et al] Proliferatie van plaatjes in PV is onafhankelijk van TPO, cfr. RBC – epo Mbv. ELISA platelet-rich plasma (PRP) serotonine levels meten in pt met myeloproferatieve aandoeningen: lagere levels in patiënten met PV, ET en myeloïde metaplasie in vergelijking met secundaire polycytemie en controle patiënten Overexpressie van PRV-1 mRNA De eerste moleculaire test voor PV was de verminderde expressie van de trombopoïetine receptor, c-mpl in plaatjes en megakaryocyten. De proliferatie van plaatjes in PV patiënten is mogelijks onafhankelijk van TPO, op zelfde manier als de proliferatie van rode bloedcellen die onafhankelijk is van EPO. Een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wordt gebruikt om platelet-rich plasma (PRP) serotonine levels te meten in patiënten met myeloproferatieve aandoeningen. PRP serotonine levels zijn significant lager in patiënten met PV, ET en myeloïde metaplasie in vergelijking met secundaire polycythemia en controle patiënten. Een tweede moleculaire test voor PV is de overexpressie van PRV-1 mRNA.

12 2. PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”
In het tweede deel gaan we het hebben over PRV-1 gen als nieuwe marker voor PV.

13 2.1. PRV-1 gen en RQ-PCR Eerst iets over het gen zelf en over kwantitatieve real-time PCR.

14 PRV-1 gen? PRV-1 mRNA overexpressie in de granulocyten van perifeer bloed bij PV i.t.t. SE, CML, AML In fysiologische toestand expressie in het beenmerg perifeer bloed, geen beenmerg! PRV-1 proteïne levels verschillen niet tussen PV en gezonde personen geen flowcytometrie, geen ELISA PRV-1 gen Behoort tot de uPAR/Ly6/CD39 receptoren Chromosoom 19 band region q Overexpressie mogelijks door aberrante transcriptie, geen structurele wijziging van het gen Rol in de pathofysiologie van PV? Bij PV patiënten is er PRV-1 mRNA overexpressie in de granulocyten van PB bij pt met PV. In het beenmerg is er in fysiologische toestand steeds expressie van PRV-1. Dus staalname is PB en geen beenmerg! Men zou logischerwijze verwachten dat dit aanleiding zou geven tot verhoogde productie van het overeenkomstig proteine. Dit is niet zo! PRV-1 proteïne levels verschillen niet significant tussen PV pt en gezonde personen, een ELISA test of flowcytometrie is dus geen optie voor de diagnose. Het gen behoort tot de urokinase type plasminogeen activator receptor familie van celoppervlakte receptoren die een cysteine-rijk domein hebben. Het ligt op chromosoom 19. De overexpressie zou mogelijks een gevolg kunnen zijn van aberrante transcriptie aangezien er geen structurele wijziging van het gen aan te tonen is. De rol in de pathofysiologie van PV in nog niet volledig opgehelderd.

15 Principe real-time PCR
Oligo dT primer bindt mRNA RT maakt 1e streng cDNA aan RT heeft endo H aktiviteit Dubbelstrengs cDNA we vertrekken van mRNA, we voegen een oligo dT primer toe die bindt aan het mRNA. het enzyme RT (reverse transcriptase) maak de 1e streng cDNA aan. Het heeft endo H activiteit en zal de oorspronkelijke mRNA afbreken en zodus een dubbelstrengs dna maken. Om de PRV-1 mRNA levels te meten is er een kwantitatieve real-time PCR ontwikkeld.

16 Principe real-time PCR
Denaturatie = splitsen van ds cDNA (95°) Annealing = binden van de primers (60°) Extension = vormen van een complementaire cDNA-streng mbv Taq-polymerase (60°) R Q het ds DNA wordt in een eerse fase gedenatureerd, dit gebeurt door de temperatuur te verhogen tot 95°C. De twee enkelstrengen zijn nu een mal voor de aanmaak van complementaire strengen. De tweede stap is het binden van de forward en reverse primers. Primers zijn kleine stukjes esdNA, meestal 20 tot 40 basen lang, die precies complementair zijn aan het uiteinde van het stukje DNA waarin we geinteresserd zijn. Het taq-polymerase is slechts werkzaam indien het een startpunt van dsDNA vindt. Nu kan het beginnen met de aanmaak van een complementaire DNA-streng. Zo ontstaan, vanaf de primers, twee nieuwe ds DNA ketens, volledig identiek aan de oorspr moeder-molecule. Bij real-time PCR maken we gebruik van een fluorofoor gelabelde probe. Real-time PCR: fluorofoor gelabelde probe!

17 Probe bestaat uit 5’ reporter label en een 3’ quencher label
Probe wordt afgebroken door de 5’ nuclease aktiviteit van het Taq- polymerase => fluorescentie ↑ Ontstaan van 2 nieuwe identieke ds cDNA ketens Opnieuw denaturatie, annealing, Zo'n probe bestaat uit een oligonucleotide met een 5' reporter label en een 3‘ quencher label. Na hybridisatie met zijn target-sequentie, wordt die afgebroken door de 5'-nuclease aktiviteit van het taq polymerase. In normale omstandigheden dimt de reporter de fluorescentie van de quencher. Bij afbraak van de probe, tijdens extensie, komt de reporter vrij en wordt de quencher niet meer onderdrukt: de fluorescentie stijgt! Er zijn nu 2 identieke ds cDNA ketens ontstaan. Het gehele proces wordt herhaald zodat een exponentiële vermenigvuldiging van de gewenste DNA-sequentie bekomen wordt. Dus opnieuw denaturatie , annealing

18 extension, denaturatie, annealing, …
Q Q R R Q Q extension, denaturatie, annealing, … Exponentiële vermenigvuldiging van de gewenste DNA-sequentie Extension, enzovoort

19 Afbraak van de probe => R komt vrij => toename in fluorescentie, uitgedrukt in CT-waarde
De CT-waarde (cycle treshold) is die cyclus waarbij een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie overschreden wordt Kwantitatieve bepaling: aan de hand van een IJKLIJN met standaard DNA en CT-waarden Hier nog eens in detail: de afbraak van de probe tijdens de PCR-reactie zorgt voor het vrijkomen van de repoter. De toename in fluorescentie wordt uitgedrukt in CT-waarde. De CT-waarde is die cyclus waarbij we een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie overschreden wordt. Aan de hand van een ijklijn met standaard DNA en de CT-waarden kan een kwantitatieve bepaling uitvoeren; daar er een duidelijk verband is tussen de CT-waarde en de concentratie van het target DNA in het staal. De CT-waarde neemt af naargelang er meer target DNA in het staal aanwezig is.

20 Standaardcurve (1) Met behulp van een plasmide:
4018 Kbp lang Bevat fragmenten van het PRV-1 gen en het house-keeping gen GAPDH (Dr. M.R. Veldwijk, German Cancer Research Center, Heidelberg) Plasmide transformatie naar E. coli DH5α, dan amplificatie Plasmideconcentratie meten in het lysaat Lineariseren van het plasmide Dn concentratie geknipt plasmide meten M.b.v. MW : aantal kopieën plasmiden berekenen GUS (ß-glucuronidase): commerciële kit De standaardcurve gaan we opstellen aan de hand van een plasmide. Dit is 4018 kilo baseparen lang en bevat fragmenten van het PRV-1 gen en het housekeeping gen GAPDH. Het plasmide hebben we gekregen van dr marlon veldwijk in Duitsland. Het plasmide wordt getransformeerd naar E. coli waarna het geamplificeerd wordt. Daarna meten we de plasmidenconcentratie in het lysaat. Na linearisatie meten we de concentratie van het geknipt plasmide. Met behulp van het moleculair gewicht kunnen we het aantal kopieën plasmiden berekenen. Voor het housekeeping gen GUS, B-glucuronidase gebruiken we een commerciële kit waarin drie potjes met 1000 plasmiden / 5 µl, plasmiden/5µL en plasmiden/5µL.

21 Standaardcurve (2) Seriële standaardreeks:
103 kopieën/5µL 104 kopieën/5µL 105 kopieën/5µL Na uitvoeren PCR: aantal kopieën t.o.v. CT-waarde Standaardcurve voor GUS Standaardcurve voor PRV-1 Elk staal (in triple): Aantal kopieën PRV-1 Aantal kopieën GUS => Ratio kopieën PRV-1/GUS Aan de hand van een verdunningsreeks (10 3, 10 4 en 10 5 kopieen/5 µL) stellen we een standaardcurve op. We stellen een standaardplot op voor GUS en PRV-1. Hier een voorbeeld van de GUS curve: We voeren PCR uit op elk van de drie verdunningen en zetten de gevonden CT waarden uit tegenover het gekend aantal kopieën. Van elk staal kunnen we op die manier het aantal kopieën afleiden uit de standaardcurves. We berekenen dan voor elk staal de ratio van het aantal kopieën van PRV-1 gedeeld door het aantal kopieën van GUS.

22 2.2. Appraisal In het volgende deel stel ik de evaluatie van onze voorlopige resultaten voor.

23 Clinical bottom line Kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA expressie met behulp van ‘real-time polymerase chain reaction’ is nuttig bij de diagnose van Polycythemia Rubra Vera of ziekte van Vacquez. De nieuwe parameter kan gebruikt worden bij patiënten met erytrocytosis, gestegen hematocriet en/of gestegen hemoglobine voor de differentiële diagnose tussen primaire en secundaire erytrocytosis. Sinds 2003 wordt de real-time kwantitatieve PCR (RQ-PCR) assay voor de expressie van het PRV-1 gen geëvalueerd voor zijn potentiële toepassingen in de klinische diagnostiek van myeloproliferatieve aandoeningen. Tot op heden wordt deze test echter niet in de routine aangeboden. De doelstelling van de PRV-1 RQ-PCR assay is die patiënten eruit te halen die volgens de PVSG criteria (en de latere aanpassingen hierop) of volgens de WHO-criteria als polycythemia vera worden gediagnosticeerd. Kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA expressie met behulp van ‘real-time polymerase chain reaction’ is nuttig bij de diagnose van Polycythemia Rubra Vera of ziekte van Vacquez. De nieuwe parameter kan gebruikt worden bij patiënten met erythrocytosis, gestegen hematocriet en/of gestegen hemoglobine voor de differentiële diagnose tussen primaire en secundaire erythrocytosis

24 1. Analytische performantiekarakteristieken
Pre-analytische variabelen Perifeer bloed, EDTA-staal Flebotomie, hydroxyurea en interferon-α hebben een invloed op PRV-1 overexpressie Bij pt met erytrocytosis moet een infectieus probleem uitgesloten worden alvorens PRV-1 expressie te gebruiken bij de diagnosestelling Staalstabiliteit: RNA extractie / aanmaken van cDNA gebeurt best binnen de 24u Er zijn geen speciale condities voor het collecteren van bloed. Bij voorkeur wordt het bloed verzameld in een EDTA-tube. Alle andere PCR’s in ons labo worden eveneens op EDTA bloed uitgevoerd. Volgens heel wat studies heeft therapie een invloed op de PRV-1 expressie, dit wordt bevestigd door onze eigen resultaten, die ik later nog zal tonen. In de literatuur vinden we ook gegevens dat patiënten met secundaire leukocytosis (na CABG en polytrauma) verhoogde expressies van PRV-1 vertonen. Meestal wordt de diagnose van PV in een ambulante setting gesteld en zal hier in de praktijk weinig rekening mee gehouden moeten worden. Verder wordt beschreven dat RNAextractie en aanmaken van cDNA best binnen de 24 uur gebeurd.

25 2. Analytische parameters intra-assay variatie:
Elk staal wordt in triple uitgevoerd Het gemiddelde van het aantal cDNA kopieën, corresponderend bij de respectievelijke CT waarden, wordt gebruikt voor de PRV-1/GUS ratio Gemiddelde intra-CV (%CT) (n = 23): 0,83% 1,27% voor PRV-1 0,39% voor GUS Elk staal werd in triple uitgevoerd. Het gemiddelde van het aantal cDNA kopieën, corresponderend bij de respectievelijke CT waarden, wordt gebruikt voor de PRV-1/GUS ratio. De gemiddelde intra-CV (%CT) voor 23 willekeurige stalen was 0,83% (1,27% voor PRV-1 en 0,39% voor GUS)

26 inter-assay variatie:
Bij elke run wordt er een standaardcurve gemaakt m.b.v. een plasmide Voor 5 runs: CV’s van de CT’s voor 1000, en kopieën/5µL 1000/PRV/CT 1000/GUS/CT 10000/PRV/CT 10000/GUS/CT 100000/PRV/CT 100000/GUS/CT 1 31 29,6 28 26,2 22,6 2 31,2 30,2 27,9 26,9 24,5 3 27,7 26,5 24,2 23 4 30,8 30,1 27,8 24,7 22,9 5 31,1 30 27,6 26,8 23,1 mean 31,02 29,9 26,66 24,14 22,84 SD 0,148 0,283 0,158 0,305 0,885 0,230 CV 0,478 0,946 0,569 1,143 3,671 1,008 Bij elke run wordt er een standaardcurve gemaakt mbv een plasmide. Dit is een vorm van inter-assay variatie. Voor 5 runs hebben we de CV’s van de CT’s van de verschillende verdunningen berekend

27 Vergelijking met EPO dosage (n = 16):
Accuraatheid (bias): afhankelijk van accuraatheid van de standaarden. Het opstellen, synthetiseren, zuiveren en kalibraties van DNA standaarden is van belang Vergelijking met EPO dosage (n = 16): Sensitiviteit PRV-1 100%, specificiteit PRV-1 100% Groot aantal stalen met normaal EPO gehalte! Prijs EPO: 17 € Prijs PRV-1 expressie: +/- 105 € De accuraatheid van de real-time PCR is volledig afhankelijk van de accuraatheid van de standaarden. Het opstellen, synthetiseren, zuiveren en kalibraties van DNA standaarden is van belang. Van 16 stalen (PV, n = 5; niet-PV, n = 11) hebben we zowel PRV-1 gen expressie bepaald en EPO dosage. Bij een cut-off van 130 is er een absolute scheiding tussen de PV pt en de niet PV pt. De sensitiviteit en de specificiteit is dus 100% voor PRV-1. Epo dosage is afhankelijk van de hematocriet. Ik kan dus geen lijn trekken tussen laag , nl en hoog epo. Daarom heb ik een nieuwe grafiek opgesteld. De pat zijn geclasseerd in nl epo, gedaald epo en gestegen epo rekening houdend met hun hematocriet. De PV patiënten hebben eerder een laag EPO gehalte, en de pt met secundaire erytropoiese hebben een hoog EPO gehalte. Toch zijn er een groot aantal stalen met normaal EPO gehalte die zowel in de PV als in de niet-PV groep behoren: epo dosage is dus weinig specifiek is. Een belangrijk verschil tussen de twee testen is wel de prijs: voor EPO dosage wordt ons 17 euro aangerekend, de prijs voor PRV-1 expressie is ongeveer 100 euro.

28 Lineariteit: correlatiecoëfficiënt
Binnen de range van 1 tot 1.106: lineair verband tussen log cDNA en de CT waarden. Referentie range: ≥ 130: PV bevestigen! (TO DO) < 130: geen PV Analytische range: Rekening gehouden met de amplificatie limiet (betrouwbaar vanaf 50 kopieën), is het analytische bereik 20 tot 40 CT’s. Turn around time (TAT): max. 1x/maand en min. 1x/2 maanden - Een veel gebruikte maat voor lineariteit is de correlatiecoëfficiënt. Binnen de range van 1 tot is er een lineair verband tussen log cDNA (gekend) en de (gemeten) CT waarden. Bij elke run wordt er een standaardcurve opgesteld voor het PRV-1 gen en het GUS gen. De correlatiecoëfficiënt wordt automatisch weergegeven, en nadert best 1. - De absolute cut-off waarde is 130. Een resultaat > of gelijk aan 130 wordt beschouwd als een overexpressie van PRV-1 en past bij polycythemia vera of ziekte van Vacquez. Een resultaat kleiner dan 130 past niet bij de diagnose van polycythemia vera. Een grotere studiepopulatie is echter nodig om deze cut-off te bevestigen (TO DO). - Rekening gehouden met de amplificatie limiet (betrouwbaar vanaf 50 kopieën), is het analytische bereik 20 tot 40 CT’s. - Momenteel worden de aanvragen verzameld tot minstens 7. Dit komt erop neer dat de test ongeveer om de 6 weken wordt uitgevoerd. Indien de test in routine aangeboden wordt, zouden we kunnen opteren om maximaal 1x/maand en minimaal 1x/2 maanden de PCR uit te voeren.

29 Inschatting van het aantal te verwachten aanvragen
a.d.h.v. EPO dosage: 51 aanvragen in 2003 48 aanvragen in 2004 (jan-okt) 52 aanvragen verkregen, waarvan 9 uit de periferie (17%) Kwaliteitscontrole: doel = de reproduceerbaarheid van de PCR bevestigen. IQC: Het plasmide met zijn verdunningen is een controle op de verschillende stappen van de PCR Bij elke PCR moet de efficiëntie hetzelfde zijn E=10(-1/slope)-1 EQC: (nabije?) toekomst Om een idee te krijgen over hoeveel aanvragen we mogen verwachten hebben we het aantal aanvragen voor erytropoïetine dosage geteld. Dit waren er 51 aanvragen in 2003 en tem oktober dit jaar al 48.. Tot op heden is PRV-1 expressie nog niet in routine en werden al 52 aanvragen verkregen, waarvan 9 uit de periferie (17%). Van de stalen uit de periferie was er geen enkel met overexpressie van PVR-1 gen. Momenteel gebeurt de test in Roeselare, Gent, Brussel en Brugge. Hasselt zou ermee bezig zijn. (Prof. Dr.Verhoef) PRV-1 expressie staat recent genoteerd op de nieuwe bonnen (3015) voor moleculair onderzoek maar is momenteel nog niet aanvraagbaar. Vermoedelijk kunnen we daardoor meer aanvragen verwachten. Het plasmide met zijn verdunningen is een controle op de verschillende stappen van de PCR. Telkens een PCR uitgevoerd wordt, moet de efficiëntie van de PCR hetzelfde zijn. De helling van de grafiek (slope) is een maat voor de efficiëntie en kan gebruikt worden om de efficiëntie te berekenen. E=10(-1/slope)-1. De variatie op de efficiëntie is dus ook een vorm van controle op de PCR. EQC bestaat momenteel nog niet voor deze test. Aangezien er enkele labo’s van de CMD’s deze test eveneens uitvoeren, zal dit voor de (nabije) toekomst zijn.

30 2. Diagnostische performantiekarakteristieken
M. Bossuyt, “Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: The STARD initiative.” Clin. Chemistry 2003;49:1,1-6 Introduction Doel: DD. PV en sec. erytrocytosis m.b.v. RQ-PCR. Methods Participants PB van pt verdacht voor PV (symptomen) PB van pt gekend met PV (reeds R/) PB van 9 gezonde donoren PB van 5 stamceldonoren onder groeifactoren retrospectieve studie! Test gouden standaard: WHO classificatie RQ-PCR: Isolatie WBC (Ficoll-Hypaque densiteit centrifugatie) Lysis RBC (NH4CL) RNA-extractie (Qiagen RNeasy Mini Kit) Aanmaken van cDNA (EAC-protocol) Primer/probe sequenties (Julian Topaly, IG, Universiteit van Heidelberg) PRV-1 plasmide (Dr. Veldwijk, German Cancer Reserarch Center, Heidelberg) Hier heb ik onze voorlopige studieresultaten nog eens geordend volgens de checklist beschreven door Bossuyt. Het doel van de studie was pt met PV te onderscheiden van pt met secundaire erytrocytosis mbv real-time PCR. We kregen van de clinici bloedstalen van de patiënten die verdacht waren voor PV op basis van hun presenterende symptomen en stalen van patiënten bij die gekend waren met PV en reeds therapie gekregen hadden. We verzamelden eveneens perifeer bloed van 9 gezonde donoren en bloed van 2 stamceldonoren onder groeifactoren. Het is een retrospectieve studie: De definitieve diagnose van de patiënten volgens de WHO criteria werd ons nadien verschaft. Als gouden standaard gold de WHO classificatie. Voor de RQ-PCR worden de witte bloedcellen eerst geïsoleerd door Ficoll-Hypaque densiteit centrifugatie. Nadien worden de rode bloedcellen geëlimineerd door lysis met buffer Voor de RNA extractie gebruiken we een Kit. Het aanmaken van cDNA gebeurt volgens het Europe Against Cancer protocol. De primers en probe sequenties zijn afkomstig van Julian Topaly, interne geneeskunde, Universiteit van Heidelberg, Duitsland. Het PRV-1 plasmide werd verkregen via Dr. M.R. Veldwijk, German Cancer Research Center, Heidelberg, Duitsland.

31 Kwantificatie PRV-1 en GUS: standaardcurven plasmiden
PCR: 25 µl reactie bevat 12,5 µl Taqman Universal Master Mix 2x (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 4,5 µl RNAse vrij water, 300 nM forward en reverse primers (Eurogentec, Belgium), 200 nM TaqMan probes (Eurogentec), en 5 µl cDNA van het plasmide. Elke analyse in triple op de ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) Negatieve controles (RNAse vrij water) De kwaliteit van het RNA en de efficiëntie van de cDNA synthese wordt gecontroleerd door de amplificatie van GUS Kwantificatie PRV-1 en GUS: standaardcurven plasmiden Uitvoering: ervaren MLT’s o.l.v. F. Houtmeyers Stabilisatie van het RNA < 24u => diepvries tot +/- 8 stalen verzameld Rapportering: ratio = # kopieën PRV-1/ # kopieën GUS Aanvankelijke cut-off: 100 Results Participants van ‘03 tot eind ‘04 / Gem. lft studiepopulatie 61 jaar (34 ♂, 17 ♀) Twee groepen: groep pt die nog geen behandeling had gekregen (n = 42) groep PV pt die reeds therapie gekregen hadden (n = 9) UZ Leuven (n = 42), Aalst (n = 7), Dendermonde (n = 2) Voor de PCR zelf gebruiken we Master Mix, RNAse vrij water, forward en reverse primers, probes, 5 µl cDNA van het plasmide. Elke analyse wordt in triple uitgevoerd. Bij elke run worden er negative controles gebruikt. De CT (threshold cycle) wordt bepaald na 50 PCR cycli. De kwaliteit van het RNA en de efficientie van de cDNA synthese wordt gecontroleerd door de amplificatie van het housekeeping gene β-glucuronidase (GUS). Voor de kwantificatie van PRV-1 en GUS worden standaardcurven opgesteld. De PCR’s werden uitgevoerd door ervaren MLT’s o.l.v. Frans Houtmeyers. De extractie van RNA en het aanmaken van cDNA gebeurde systematisch binnen de 24u. Het stabiele, aangemaakte cDNA werd dan ingevroren tot er +/- een achttal stalen verzameld waren, dan werd een run ingezet. De resultaten werden gerapporteerd aan de clinici als een ratio (het aantal kopieën van PRV-1 / het aantal kopieën van GUS). Aanvankelijk werd de cut-off vastgelegd op 100. Bij het rapporteren van de resultaten was er geen enkele klinische informatie ter beschikking van de patiënten. De studie liep van 2003 tot einde 2004, de gemiddelde leeftijd was 61 jaar. We verdeelden de resultaten in twee groepen; een groep pt die geen therapie gekegen hadden en een groep van pt met PV die reeds behandeld waren. Uit leuven kregen we 42 stalen, 7 uit Aalst en 2 uit Dendermonde.

32 Test results Estimates Discussion
gezonde donoren: range 2,64- 39,4; mean 8,9 Stamceldonoren onder GF: range 77,6 – 230,4; mean 139,5 PV, reeds R/: range 6,2 – 1147; mean 271 PV, niet R/: range 140,1 – 1372; mean 681,8 Sec. erytrocytosis: range 0,4 – 129,2; mean 34,8 Invloed van therapie! Bij exclusie groep reeds R/: cut-off 130 Estimates Sensitiviteit: 100% Specificiteit:100% LR+ve= oneindig LR-ve = 0 NND = 1 Reproduceerbaarheid: intra-assay 0,83% inter-assay 1,3% Discussion Hoewel kleine studiepopulatie: kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA heeft een waarde bij de diagnosestelling van pt met erytrocytosis. Cut-off 130 bevestigen (TO DO) bij gezonde donoren was de gemiddelde ratio 8,9, dit is een lage PRV-1 gen expressie stamceldonoren onder groeifactorentherapie: hadden een hogere PRV-1 gen expressie , gemiddeld 139,5 PV, behandelde patiënten hadden laag tot hoge PRV-1 expressie levels gemiddelde 271 PV, niet behandelde patiënten: hoge PRV-1 expressie levels met een gemiddelde van 681,8 Pt met Secundaire erytrocytosis: hadden lage PRV-1 expressie levels met een gemiddelde van 34,8 De groep van patiënten met PV die al behandeld warden, hadden wisselende ratio’s. Uit de literatuur blijkt dat de ratio beïnvloed wordt door therapie. Na exclusie van deze groep was er een duidelijke scheiding tussen PV (onbehandelde) patiënten en patiënten met secundaire erytrocytosis. Bij een cut-off van 130, is de sensitiviteit en de specificiteit 100%. Positieve en negatieve Likelihood ratio’s zijn respectievelijk oneindig en 0. Number needed to diagnose is 1 De reproduceerbaarheid hebben we reeds besproken. Hoewel onze studiepopulatie klein is, suggereren onze data dat kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA m.b.v. real-time PCR een waarde heeft bij de diagnosestelling van patiënten met erytrocytosis. Om de cut-off van 130 te bevestigen, is het nodig om nog meer analyses uit te voeren bij patiënten die nog geen therapie kregen.

33 disease no disease 1 0,4 2 3 5,95 4 7,4 5 7,5 6 7,8 7 7,9 8 10 9 11 18,06 12 18,7 13 19,3 14 20 15 21,6 16 21,66 17 18 29 19 29,5 21 31,05 22 41,5 23 43,77 24 46 25 49 26 51,2 27 52 28 56 64,7 30 71 31 88 32 127 33 129,2 disease no disease 34 140,1 35 153,9 36 163 37 279 38 321,9 39 324 40 1029,9 41 1372 42 2352 Hier een grafiek van de ruwe data. Er is een duidelijke scheiding tussen de groep van pt met PV die een maximum hebben van 128,5 en de pt met secundaire erytrocytosis hebben een minimum van 140,1. PV Niet-PV

34 3. Klinische impact Diagnostisch aspect: Behandeling:
nut bij diagnose PV (DD. prim/sec erytrocytosis) Evt. EPO dosage en/of EEK’s vervangen Cytologie levert geen meerwaarde op in de diagnostiek van PV (tenzij DD. myeloproliferatieve ziekte) Botboorbiopsies: richtinggevend cytogenetica: minderheid + Behandeling: interferon: down-regulatie van PRV-1 expressie PRV-1 expressie: merker voor klinische respons? Health outcome: juiste diagnosestelling! In de literatuur (nog) geen evidentie dat PRV-1 gen bepaling de outcome verbetert Prognose en follow-up: / Kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA expressie is nuttig bij de diagnose van PV. En zou eventueel epo dosage en of beenmergkweek kunnen vervangen Cytologie van het beenmerg levert geen meerwaarde in de diagnostiek van PV. Bij twijfel over de differentiële diagnose met andere myeloproliferatieve aandoeningen is cytologie wel geïndiceerd. Botboorbiopsies zijn vaak vrij richtinggevend. Cytogenetica is slechts in een minderheid van de gevallen afwijkend. In de literatuur wordt een down-regulatie van PRV-1 expressie na therapie met interferon-α beschreven. Grote gecontroleerde studies zijn echter nodig om te kunnen besluiten dat de merker met klinische respons correleert. Het is belangrijk dat de parameter aangevraagd wordt bij het begin van de investigatie naar PV. Eens met gestart is met een behandeling is de ratio waardeloos. Het stellen van de juiste diagnose is belangrijk. Stel dat een secundaire polycythemia behandeld wordt met hydrea en de patiënte doet een secundaire leukemie dan is de outcome van de patiënt slecht. In de literatuur is er (nog) geen evidentie dat PRV-1 gen bepaling de outcome van de patient zou verbeteren. PRV-1 gen bepaling wordt tot op heden nog niet gebruikt voor prognostische doeleinden en heeft geen plaats in de follow-up van de patient.

35 4. Organisatorische impact
Impact in het ziekenhuis: Beenmergcytologie is geen criterium. Morfologisch onderzoek vergt +/- 1 uur werk voor MLT/GSO-ASO/supervisor Beenmergkweek is tijdrovend en kostelijk. Momenteel wordt het enkel uitgevoerd bij twijfel over de diagnose ( Er is geen verkorting hospitalisatieduur (meestal ambulante setting) Is PRV-1 geïncorporeerd in klinische richtlijnen of guidelines? H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4) ‘European Leukemia Network’ zal binnen enkele maanden guidelines publiceren voor de standaardisatie van het RQ-PCR assay Voorstel PVSG criteria verder aan te passen Heeft PRV-1 mRNA bepaling impact in het ziekenhuis? Beenmergcytologie is geen criterium bij de diagnosestelling voor PV (zowel niet in de WHO, als in de PVSG). Dit onderzoek wordt dikwijls samen uitgevoerd met een botboorbiopt. Het uitvoeren van de punctie op zich is niet tijdrovend of pijnbesparend aangezien er toch een botboorbiopsie en een aspiraat voor cytogenetica en/of beenmergkweek verricht wordt. Beenmergcytologie vergt echter +/- een uur werkt voor laborant/assistent/supervisor. Tenzij er ook nog gedacht wordt aan een andere myeloproliferatieve ziekte is dit onderzoek overbodig. Beenmergkweek is een tijdrovend en kostelijk onderzoek. Dit onderzoek wordt enkel uitgevoerd bij twijfel, in afwezigheid van EPO, clonaliteitsonderzoek ( (hematologisch handboek) PRV-1 gen bepaling is een test die beenmergkweek kan vervangen. Er is geen verkorting van de hospitalisatieduur omdat de patiënt niet opgenomen wordt. Is PRV-1 geïncorporeerd in klinische richtlijnen of guidelines? Het ‘European Leukemia Network’ zal binnen enkele maanden guidelines publiceren voor de standaardisatie van het RQ-PCR assay. Hierdoor zal het mogelijk worden resultaten uniform en vergelijkbaar te maken tussen verschillende instellingen [1]. De auteur Pahl stelt voor om de gemodifieerde PVSG criteria verder aan te passen.

36 Diagnose PV: A1 + A2 + A3 of A4 A1 + A2 + twee B’s
Overexpressie van PRV-1 zou een minor criterium zijn voor de diagnose van PV. Het B4 criterium wordt dan BFU-E groei OF laag EPO OF PRV-1 overexpressie. H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4)

37 5. Kostprijs: binnen en buiten het labo
Actuale kost Rekening houdend met de reagenskost, distributiekosten, primaire en secundaire activiteiten: 105 € per patiëntenstaal in batch van 10 stalen Terugbetaling CMD’s ontvangen een ‘enveloppe’, geen RIZIV tussenkomst Voordeel elders in het ziekenhuis PRV-1 kan EPO dosage vervangen PRV-1 expressie + EPO dosage kan beenmergkweek vervangen (moeilijke standaardisatie, arbeidsintensief, niet kosten-effectief) RBC-massa bepaling is niet steeds nodig (volgens clinici routinematig aangevraagd) – HTC > 56% (♀), HTC > 60% (♂) => PV (PVSG) – Hb > 16,5 g/dL (♀), Hb > 18,5 g/dL (♂) : major criteria volgens WHO De kost van de test kan men vergelijken met de kosten van een real-time PCR voor een translocatie. Rekening houdend met de reagenskost, distributiekosten, primaire activiteiten en secundaire activiteiten kost een de PRV-1 real-time PCR ongeveer 105 euro per patiëntenstaal uitgevoerd in batch van 10 stalen. Deze prijs komt overeen met de gemiddelde prijs van een PCR. Er is geen RIZIV terugbetaling voorzien voor deze moleculaire test. De CMD’s ontvangen een ‘enveloppe’ waarmee ze hun kosten moeten opvangen. PRV-1 mRNA bepalling zou een voordeel kunnen betekenen elders in het ziekenhuis: 1. De PRV-1 test zou in de toekomst een vervanging kunnen zijn voor de erytropoïetine dosage test. 2. Volgens Prof. Dr. Bogaerts zou PRV-1 expressie in combinatie met EPO dosage beenmergkweek kunnen vervangen. Hij is van menig dat deze test moeilijk te standaardiseren valt, arbeidsintensief en zeker niet kosteneffectief is. 3. Rode bloedcelmassa is niet steeds nodig. (wat volgens de clinici routinematig wordt uitgevoerd). Wanneer het hematocriet hoger is dan 56% bij vrouwen of 60% bij mannen kan de diagnose polycytemie bijna met zekerheid worden gesteld bij uitsluiting van een secundaire oorzaak (gemodifieerde PVSG). Indien bij vrouwen het hemoglobinegehalte hoger is dan 16,5 g/dL en bij mannen hoger dan 18,5g/dL, dan is dit volgens de WHO een major criteria en hoeft de RBC-massa niet meer bepaald te worden. Dit criterium is minder streng aangezien 18,5 g/dl en 16,5g/dl ongeveer overeenkomt met een hematocriet van 54 en 48% respectievelijk.

38 6. Decision making Impact van PRV-1 op het klinisch beslissing proces
VOORSTEL DIAGNOSEREGEL: Klinische vermoeden van PV Uitsluiten ET ! HTC > 52 % (♂), HTC > 48 % (♀) (uptodate) HTC > 50% (♂), HTC > 48% (♀) ( Beenmergmorfologie is een overbodig onderzoek RBC massa bepaling is niet steeds nodig Past de test binnen het eigen labo profiel? De test staat volledig op punt. De PCR is gelijkaardig aan andere real-time PCR’s: minimum aan opleiding MLT Lage frequentie test: uitvoeren indien er tijd is Stalen opsturen naar ander labo: verlies kwaliteit (cfr. Stabiliteit!) Besluit: flowchart Om overconsumptie te vermijden is het nuttig om een diagnoseregel op te stellen. We voeren de PRV-1 mRNa bepaling slechts uit indien er een klinisch vermoeden is van PV en de hematocriet > 50% (man), hematocriet > 48% (vrouw) zonder bloeding of Fe-tekort Door dit criterium te stellen, sluiten we patiënten met trombocytose uit. Dit is belangrijk aangezien deze patiënten soms ook overexpressie van PRV-1 gen vertonen. De verklaring hiervan is dat er een overgang van de ene naar de andere aandoening mogelijk is. Beenmergmorfologie is een overbodig onderzoek. Beenmergpunctie blijft enkel nodig voor cytogenetica en in de differentiële diagnostiek van myeloproliferatieve ziekten. Rode bloedcelmassa is niet steeds nodig indien hematocriet of hemoglobine extreem hoog is. (wat volgens de clinici routinematig wordt uitgevoerd). De test heeft dus een impact op het beslissingproces van de clinicus. past de test binnen het eigen ‘labo profiel’? Praktisch gezien staat de test volledig op punt. Gezien deze PCR gelijkaardig is aan andere real-time PCR’s, is er slechts een minimum aan opleiding nodig voor de MLT’s voor het uitvoeren van de PCR. Omdat de frequentie van uitvoering van de test niet hoog ligt, kan hij gebeuren wanneer er tijd is. Er is dus geen extra MLT nodig. Indien we de stalen opsturen naar een ander labo, verliezen we aan kwaliteit, cfr. staalstabiliteit! We kunnen besluiten dat PRV-1 gen expressie is een performante parameter in de diagnosestelling van PV en meer bepaald om het onderscheid te maken tussen secundaire erytrocytosis en polycythemia vera.

39 Trombocytosis (> 400 x 109/l) WBC (> 12 x 109/l)
Vermoeden PV WHO Trombocytosis (> 400 x 109/l) WBC (> 12 x 109/l) Splenomegalie (klinisch/echo) Gestegen hematocriet / hemoglobine STAP 1 DD Absolute of relatieve erytrocytose? STAP 2 PVSG WHO * HTC > 56% vrouw HTC > 60% man Hb > 16,5 g/dl vrouw Hb > 18,5 g/dl man Relatieve erytrocytose: diurectica, dehydratatie, vochtsequestratie Ja: stap 3 Neen: RBC-massa bepalen STAP 3 Absolute erytrocytose: secundaire of primaire erytrocytose? zuurstofsaturatie: gedaald carboxyhemoglobinegehalte verhoogd: rookstop 3-4m PRV-1 expressie botbiopsie cytogenetica (EPO) (beenmergkweek) Deze flow-chart vat alles nog eens samen. Bij vermoeden van PV moeten we eerst uitmaken of het gaat om absolute of relatieve erytrocytosis, al dan niet mbv rode bloedcelmassa bepaling Indien absolute erytrocytosis bevestigd is moeten we secundaire oorzaken uitsluiten. Hier gaan we logisch te werk, afhankelijk van patiënt kunnen we zuurstofsat meten, carboxyhemoglobineghalte, enz.. PRV-1 mRNA expressie mag zeker niet ontbreken. Evt. botboorbiopise en cytogenetica. Kosten-baten lijkt het ons logisch om eerst de beenmergkweek achterwege te laten. In tweede instantie kan overwogen worden om EPO dosage te laten *Dit criterium is minder streng aangezien 18,5 g/dl en 16,5g/dl ongeveer overeenkomt met een hematocriet van 54 en 48

40 Opstellen van een werkvoorschrift indien de test in de routine komt
TO DO / ACTIONS Reëvalutie cut-off Opstellen van een werkvoorschrift indien de test in de routine komt Aanvragers uit periferie verwittigen voor staalstabiliteit Om de cut-off te bevestigen is het nodig om nog meer testen uit te voeren. Er is nog geen werkvoorschrift voorhanden. De aanvragers uit de periferie zullen verwittigd worden voor de staalstabiliteit.

41 Dank u voor uw aandacht! Speciale dank aan: Dr. N. Boeckx Dr. J. Frans
Frans Houtmeyers Prof. F. Van Stapel